精氨酸代谢在中华绒螯蟹螺原体抗逆和致病过程中的分子机制研究

The Spiroplasma eriocheiris is a newly discovered crustacean pathogenic bacteria. Its genome is very small and lack many metabolic pathways, but the arginine metabolism being called “the second energy pathways” exist in S. eriocheiris and include arginine deiminase (ADI) system and agmatine deiminase (AgDI) system. S. eriocheiris in nature often suffers the dramatic change of environmental factors such as pH and temperature. Whether arginine metabolism plays an important role in stress resistance and pathogenic process? This issue will be studied in this fund. The stress resistance phenomenon of S. eriocheiris has been studied by our lab. The five key enzymes in arginine system including ADI, OTC, CK, AgDI and PTC was cloned and recombinant expressed. Firstly, their variation tendency under unfavorable conditions will been study by real time quantitative PCR and Western blot. Secondly, the recombinant protein enzyme activity and virulence analysis in cell apoptosis will been determined using antibody blocking experiments. Finally, the S. eriocheiris AgDI genes will been transformed into Spiroplasma mirum that does not contain AgDI system. S. mirum mutant will be used to study the changes in growth index, enzyme activity and infect ability to host cell. Through the above study, the mechanism of arginine metabolic from S. eriocheiris in stress resistance and pathopoiesis will be final confirmated.

中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)是新发现的虾蟹病原菌，基因组非常精简，却保留着精氨酸脱亚胺酶(ADI)系统和鲱精胺脱亚胺酶(AgDI)系统。同时S. eriocheiris在自然界中常遭遇环境剧烈变化的不利影响，而精氨酸代谢起怎样的作用？本项目从已发现的S. eriocheiris抗逆现象入手，首先克隆和重组表达精氨酸系统中的ADI、OTC、CK、AgDI和PTC，利用实时定量PCR和Western blot技术研究它们在不利条件下的变化；然后测定重组蛋白酶活性，并利用抗体阻断、细胞凋亡等实验对蛋白毒力进行分析；最后把S. eriocheiris AgDI系统转化入不含有AgDI系统的非凡螺原体内，利用非凡螺原体重组株研究其生长指标、酶活性及其对宿主感染能力的变化。通过以上研究最终确认精氨酸代谢在S. eriocheiris抗逆和致病过程中的作用机制。

本项目自批准以来，本项目基本上按照原有技术路线进行，但是也存在一些变动。项目本计划从螺原体的抗逆现象入手，首先克隆和重组表达Spiroplasma eriocheiris精氨酸系统中的基因和蛋白，利用实时定量PCR和Western blot技术研究它们的性质；同时把S. eriocheiris的AgDI系统转化入不含有AgDI系统的非凡螺原体内，研究其变化，以确认精氨酸代谢的作用。在项目执行过程中首先证明培养基中添加精氨酸时，S. eriocheiris生长速度明显增加，其平台期明显变长。同时成功克隆和原核表达了S. eriocheiris的ADI、OTC、CK、AgDI和PTC，通过QPCR和Western blot从分子层面上研究S. eriocheiris在不同环境条件下精氨酸系统ADI、OTC、CK、AgDI和PTC的基因和蛋白水平表达量变化情况，结果表明精氨酸系统蛋白在高温和酸性(pH=5)等不良的环境下，ADI、OTC、CK、AgDI和PTC基因的转录量明显上调，蛋白的表达量显著升高；在培养基中高浓度糖类时，它们的活性会被明显的抑制。而后通过基因组学重分析、差异转录组学和蛋白组学分析等技术未能发现鸟氨酸脱羧酶和精氨酸脱羧酶的相关信息。然后本项目按照技术成功构建了S. eriocheiris的遗传体系，但是未能成功转化S. eriocheiris AgDI系统进入非凡螺原体，未能通过过表达确认精氨酸代谢的作用。除了项目计划书中的研究内容，本项目还通过抗体筛选抗原蛋白证明ADI、OTC和CK蛋白为重要的抗原蛋白、ADI和OTC是重要的抗原膜蛋白，并在致病过程中其重要的作用；并利用修饰蛋白组学技术证明S. eriocheiris ADI、OTC、A/O和CK蛋白的乙酰化（磷酸化）修饰位点分别是14（2）、11（1）、1（1）、10（2）个，证明乙酰化和磷酸化修饰可以调节S. eriocheiris AgDI系统的功能。因此S. eriocheiris精氨酸代谢系统在螺原体代谢、抗逆和致病过程中具有非常重要的作用。