用EPR技术测量蛋白质分子内选定位点之间的距离

确定蛋白质分子中不同区域之间的位置和距离对蛋白质的结构解析至关重要。本课题拟在溶液环境下建立准确测量蛋白质分子内选定位点之间距离的方法。通过构建尺寸确定的双自旋化合物作为分子标尺，在0.5-2.5nm范围建立EPR测量距离的刻度标准，实现对实测距离的校正，在双点突变的蛋白质模型样品上利用EPR-SDSL技术测量突变点间距离，检验所建立方法的实用性，达到提高连续波EPR测量距离的准确度和蛋白质结构解析可靠性的目的。

测量蛋白质分子中不同区域之间的距离及其构象动态变化对研究蛋白质的结构与功能关系具有重要意义。本课题开展了用EPR波谱技术在溶液环境中测量生物分子内距离的方法及其应用研究。为校正测量距离的准确度, 完成了多种刚性骨架结构单/双自旋标尺化合物的合成与结构鉴定，获得了3种碳60骨架双自旋标尺化合物异构体，其结构稳定, 适用距离范围为0.9-1.2nm；针对连续波EPR波谱计算距离所存在的实际问题，编写了波谱拟合-傅里叶去卷积双自旋间距离计算软件，克服了部分人为误差，改善了距离计算精度；为适应各种生物实验环境，开展了不同温度下双自旋间距离的测量方法和刻度方法实验。构建了LSECtin蛋白质糖基结合域CRD分子上6个单点半胱氨酸突变体和2组双点半胱氨酸突变体实验模型，实现了各突变点的定点自旋标记。以LSECtin-CRD和牛血清白蛋白为实验模型，用SDSL-EPR波谱技术测量了蛋白质在溶液中的构象变化和选定位点的运动特性，初步获得了蛋白质与配体结合的构象变化特征。受双点突变蛋白样品纯度的影响,目前对生物样品内距离测量的实际应用还在进行中，距离刻度范围也有待进一步扩展。