hsa_circ_RPPH1 / hsa_circ_0003596 调控循环肿瘤干细胞间充质-上皮转化促进肝癌转移的机制研究

Circulating cancer stem cells are the key factor of tumor recurrence and metastasis. The mesenchymal-to-epithelial transition(MET) is pivotal for metastasis of circulating cancer stem cells to specific target organs, which mechanism remains largely unclear. Previous studies have suggested there is a close relationship between circRNA and cell transformation. We found that hsa_circ_RPPH1 in hepatocellular carcinoma stem cells(CSCs) can affect its self-renewal, and hsa_circ_0003596 expression is abnormal during MET program in vitro. Moreover, the expression patterns of these two circRNAs are correlated negatively. In this study, we use hsa_circ_RPPH1 and hsa_circ_0003596 as an entry point to further study: 1) To determine the biological functions of hsa_circ_RPPH1 and hsa_circ_0003596 in CSCs self-renewal and MET occurrence using loss-of-function and gain-of-function experiments at the cellular level; 2) To elucidate the regulation mechanism of hsa_circ_RPPH1 and hsa_circ_0003596 in circulating cancer stem cells before and after transplanting target organs using the mouse models combined with RNA pull down and so on; 3) To analyze the diagnostic role of key molecules in clinical samples using real-time PCR. We aim to provide a molecular target for diagnosis and intervention of tumor metastasis.

循环肿瘤干细胞是肿瘤转移的关键因素，其间质-上皮转化（MET）是肿瘤转移至特定靶器官的关键过程，机制尚不明确。circRNA与肿瘤细胞MET关系密切。我们前期研究发现，hsa_circ_RPPH1调控肝癌干细胞自我更新，肝癌干细胞体外发生MET时hsa_circ_0003596显著上调，这两种circRNA表达模式呈负相关。本研究拟以此为基础，在细胞和动物水平深入开展以下研究：1）利用功能获得与缺失实验，在细胞水平确定hsa_circ_RPPH1和hsa_circ_0003596在肝癌干细胞自我更新与MET中的调控作用和机制；2）利用肝癌小鼠模型结合RNA pull down等技术研究循环肿瘤干细胞在靶器官定植前后hsa_circ_RPPH1和hsa_circ_0003596调控机制及重要相关分子；3）利用定量PCR分析关键分子在临床肿瘤转移中的诊断作用。以期为肿瘤转移和治疗提供诊断依据。

循环肿瘤干细胞是肿瘤转移的关键因素，其自我更新、间质-上皮转化是肿瘤转移至特定靶器官的关键过程，机制尚不明确。课题组利用circRNA高通量测序技术，发现了原发灶肝癌干细胞中多种异常表达的circRNA，提示circRNA在肝癌转移中发挥重要作用。基于此，课题组利用功能获得与缺失、细胞和小鼠模型、蛋白抗体芯片以及RNA pull down等技术充分阐释了circMALAT1通过与核糖体、肿瘤抑制基因PAX5 mRNA形成一种全新的三元复合体，抑制PAX5 mRNA的翻译；同时，circ-MALAT1还吸附miR-6887-3p上调JAK2表达，激活JAK2/STAT3信号通路，通过正反两个方向维持肝癌干细胞的自我更新。肺转移是肝癌患者死亡的主要因素。课题组证实术前5毫升血液中的ICAM-1+循环肿瘤干细胞计数大于3是临床肝细胞癌患者肺转移的一个危险因素。循环肿瘤干细胞异常地过度表达circ-CDYL，产生更多的循环肿瘤干细胞来增强小鼠的肺转移。机制上，circ-CDYL促进了COL14A1的表达，从而促进了ERK信号的传递，促进了上皮-间质转变。其中RNA结合蛋白EEF1A2作为一种新的转录（共）因子，与circ-CDYL合作并启动COL14A1的转录。而在缺氧微环境下，由HIF-1⍺介导的其亲本基因CDYL和剪接因子EIF4A3的转录上调引起了circ-CDYL的高水平。因此，缺氧微环境通过HIF-1⍺/circ-CDYL-EEF1A2/COL14A1轴使循环肿瘤干细胞发生高倾向性肺转移。此外，课题组还发现肿瘤干细胞中异常低表达的circ-COL5a1受TDP43调控，进而抑制肝癌细胞迁移。原代间质型肝癌细胞和肿瘤干细胞中异常高表达circ-LTBP2可通过促进MEK1/2磷酸化正调控Raf/Ras/Mek/Erk通路。circ-LTBP2具有编码潜能，编码蛋白具有糖基化和磷酸化修饰位点和EGF结构域，提示肝癌干细胞中circ-LTBP2可能通过修饰位点和结构域发挥重要生物学作用。以上结果系统探讨了circRNA在肝癌中的发展转移机制，揭示了环circRNA、肝癌干细胞、循环肿瘤干细胞、原发灶和转移靶器官之间独特的交互作用，为临床肝癌转移和治疗提供了新的思路。