microRNA-329调控泛素特异性蛋白酶22在肝细胞癌侵袭和转移中的作用及机制研究

Ubiquitin-specific protease 22 (USP22) plays an important role in a variety of tumor's invasion and metastasis. In previous work, the applicant found that microRNA-329 (miR-329) levels was downregulated in hepatocellular carcinoma cell lines with metastatic potential. Moreover, USP22 expression is regulated by miR-329. It is reasonable to suggest that miR-329 could target USP22 to affect HCC's invasion and metastasis. This study will further validate the interaction between miR-329 and USP22, identify the sites of action. Clarify the effect of miR-329 in the process of HCC's invasion and metastasis. Verify the effect of miR-329 regulates the signal transduction pathway of HCC's invasion and metastasis by using the Protein Pathway Array technology combined with the Ingenuity Pathway Analysis software. Elucidate the mechanism of miR-329 affect HCC's invasion and metastasis from the perspective of the signal transduction pathway. It is expected to clarify the function of miR-329 targeting USP22 in invasion and metastasis of HCC and its mechanism through this study, which provide theoretical basis and new therapeutic targets for establishing corresponding blocking pathways.

泛素特异性蛋白酶22（USP22）在多种恶性肿瘤侵袭和转移过程中发挥重要作用。申请者在前期工作中发现microRNA-329（miR-329）在具有转移潜能肝癌细胞系中表达下调，并且USP22的表达受到miR-329调控。提示miR-329可能通过调控USP22进而影响肝细胞癌（HCC）侵袭和转移。本研究将进一步验证miR-329与USP22之间的相互作用，并确定作用位点；明确miR-329在HCC侵袭和转移中的作用；并利用Protein Pathway Array技术结合Ingenuity Pathway Analysis分析软件验证miR-329调控USP22对HCC侵袭和转移信号传导网络的影响，从信号传导通路角度阐明miR-329影响HCC侵袭和转移的机制。通过本研究有望阐明miR-329调控USP22在HCC侵袭和转移中的作用及机制，为建立相应的阻断途径提供理论依据及新的阻断靶点。

肿瘤转移是一个复杂、多阶段的演化过程，受多种因素的调节。大量研究证实转移相关基因及细胞信号传导通路的变化与肿瘤的转移能力密切相关。去泛素化酶USP22通过去泛素化特点蛋白，对肝癌的侵袭和迁移具有重要作用。我们发现miR-329在肝癌中表达下调，并且USP22的表达受到miR-329调控。提示miR-329可能通过靶向调控USP22进而影响肝癌侵袭迁移能力。本研究拟采用双荧光素酶和突变实验进一步验证miR-329与USP22的相互作用，并确定作用位点；明确miR-329在肝癌侵袭迁移中的作用；利用Protein Pathway Array（PPA）技术结合Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析软件验证miR-329靶向调控对肝癌侵袭迁移信号传导网络的影响，从信号传导通路角度阐明miR-329影响肝癌侵袭迁移能力的机制。我们的结果发现肝癌组织中USP22表达水平明显高于癌旁正常肝脏组织；相反，肝癌组织中miR-329表达水平明显低于癌旁正常肝脏组织。此外，USP22高表达及miR-329低表达与肝癌患者预后差密切相关。我们发现miR-329在具有侵袭和迁移能力的肝癌细胞株中表达水平显著下调，而USP22的表达水平却明显增加。在上调或下调miR-329后，肝癌细胞的增殖能力、侵袭和迁移能力均发生明显变化。这些结果在裸鼠体内实验也得到了证实。说明miR-329在肝癌侵袭转移过程中发挥重要的调控作用。我们在探索miR-329对肝癌侵袭迁移信号传导网络影响过程中发现，miR-329调控USP22可影响多种与侵袭迁移相关的基因，尤其是AMPK信号通路蛋白。上调miR-329表达后肝癌细胞中AMPK、mTOR、p70S6K及p4EBP1蛋白的表达水平均明显下降，然而过表达USP22则可以恢复上述蛋白的表达水平。进一步发现在肝癌细胞中，蛋白酶体抑制剂MG132可逆转USP22对AMPK蛋白的降解；此外，与对照细胞相比，下调USP22后AMPK蛋白的稳定性降低。同时我们也发现上调miR-329或下调USP22表达后与肿瘤血管生成、侵袭转移相关的MMP-2、MMP-7、MMP-9蛋白表达水平明显下降。这更加丰富了肿瘤干细胞调控肿瘤侵袭迁移的理论依据，为我们后续的研究提供了有力的理论支持。总之，通过本研究初步阐明了miR-329靶向调控USP22在肝癌侵袭转移中