microRNA-101靶向调控EZH2在肝癌化疗耐药中的作用及机制研究

Multibar gene EZH2 plays an important role in the occurrence and development of chemotherapeutic resistance of liver cancer by methylating specific genes. On the basis of previous research, the applicant found that microRNA-101 (miR-101) was downregulated in chemotherapy-resistant liver cancer cells, and EZH2 expression was also regulated by miR-101. Suggesting that miR-101 may thus affect the chemoresistance of liver cancer by targeting EZH2 gene. The project intends to use dual luciferase experiment and mutagenesis experiment to verify the interaction between miR-101 and EZH2 and to determine the acting site; clearing the role of miR-101 in liver cancer chemotherapy resistance; using Protein Pathway Array (PPA) technology combined with Ingenuity Pathway Analysis (IPA) analysis software to validate the effects of miR-101 targeting regulation on signaling transduct network of chemoresistance of liver cancer,clarifying the mechanism on effects of miR-101 on liver cancer chemoresistance from aspects of signal transduction pathways. This research is expected to clarify the effects and mechanism of miR-101 targeting EZH2 on chemotherapeutic resistance of liver cancer, which provide new ideas and experimental clues for the research and treatment of chemotherapeutic resistance of liver cancer.

多梳基因EZH2通过甲基化特定基因，对肝癌化疗耐药的发生发展具有重要作用。申请者在前期工作中发现microRNA-101（miR-101）在肝癌耐药细胞中表达下调，并且EZH2的表达也受到miR-101的调控。提示miR-101可能通过靶向调控EZH2进而影响肝癌耐药性。本研究拟采用双荧光素酶和突变实验进一步验证miR-101与EZH2的相互作用，并确定作用位点；明确miR-101在肝癌化疗耐药中的作用；利用Protein Pathway Array（PPA）技术结合Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析软件验证miR-101靶向调控对肝癌化疗耐药信号传导网络的影响，从信号传导通路角度阐明miR-101影响肝癌化疗耐药的机制。通过本研究有望阐明miR-101靶向调控EZH2在肝癌化疗耐药中的作用及其机制，为肝癌化疗耐药的机制研究和应用治疗提供新的思路和实验线索。

原发性肝癌是世界排名第五的恶性肿瘤，目前我国的发病人数占全球肝癌患者的一半以上。肝癌化疗耐药性的产生是一个复杂的、多阶段的演化过程，受到多种因素的调节。多梳基因EZH2通过甲基化特定基因，对肝癌化疗耐药的发生发展具有重要作用。申请者在前期工作中发现microRNA-101（miR-101）在肝癌耐药细胞中表达下调，并且EZH2的表达也受到miR-101的调控。提示miR-101可能通过靶向调控EZH2进而影响肝癌耐药性。本研究拟采用双荧光素酶和突变实验进一步验证miR-101与EZH2的相互作用，并确定作用位点；明确miR-101在肝癌化疗耐药中的作用；利用Protein Pathway Array（PPA）技术结合Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析软件验证miR-101靶向调控对肝癌化疗耐药信号传导网络的影响，从信号传导通路角度阐明miR-101影响肝癌化疗耐药的机制。我们成功建立人肝癌耐药细胞株Bel/Fu、HepG2/CDDP，发现miR-101在这两株耐药细胞中显著下调，而EZH2的表达水平却明显增加，并且在152例临床病例检测中发现miR-101下调的患者耐药性发生率显著增加并影响患者的远期生存率，这与EZH2的表达作用截然相反。在上调或下调miR-101后肝癌耐药细胞的增殖能力、侵袭和迁移能力以及细胞的耐药性均发生明显的变化，此外，这些结果在裸鼠体内实验也得到了证实，说明miR-101在肝癌耐药过程中发挥了重要的调控作用；并且EZH2的表达水平也随之改变，证明EZH2是miR-101的直接作用靶基因。我们在探索miR-101对肝癌耐药细胞信号传导网络的影响过程中发现，miR-101调控EZH2可影响多种关键耐药基因表达水平的改变，进而直接干预肝癌耐药性的产生；同时，意外的发现miR-101调控EZH2能够影响耐药细胞中干细胞标志物ATOH8的表达水平，这更加丰富了肿瘤干细胞调控肿瘤耐药的理论依据，为我们后续的研究提供了有力的理论支持。总之，通过本研究初步阐明了miR-101靶向调控EZH2在肝癌化疗耐药中的作用及其分子机制，为肝癌化疗耐药的机制研究和应用治疗提供了新的思路和实验线索。