血小板衍生生长因子D诱导内皮祖细胞促血管新生及机制研究

Platelet—derived growth factor D（PDGF-D） is a newly member of the PDGF family.Its molecular structure suggests it has a biologiacl activity of promoteangiogenesis, but the specific regulation and signal transduction mechanismremains remain unclear. This study will investigate the effect of PDGF-D on EPCs mobilization , homing, differentiation , screen signaling molecules and signaling pathways involved in this process, and detect its expression characteristics and features.Furthermore, the effect of therepetic angiogenesis of PDGF-D gene-transfectied endothelial progenitor cells on arterial ischemia and venous thrombosis will be estimated and the biological role of PDGF-D angiogenesis and its signaling regulatory mechanism will be analyzed, which will provide a theoretical basis for the further therapetic application of PDGF-DD combined with endothelial progenitor cells in arterial isthemic disease and venous thromboembolism.

血小板衍生生长因子D（PDGF-D）是PDGF家族的新成员，其分子结构提示存在促血管新生作用，但具体调控和信号传导机制依然不清楚。我们将在前期研究基础上深入探讨PDGF-D对内皮祖细胞动员、归巢、分化的影响，同时筛查可能参与此过程的信号分子和信号传导途径，检测其表达特点和功能特点，并观察携DGF-D腺病毒转染的内皮祖细胞对动脉缺血和静脉血栓动物模型的干预效果，试图阐明PDGF-D促血管新生的生物学作用及信号调控机制，为进一步运用PDGF-DD联合内皮祖细胞治疗动脉缺血性疾病和静脉血栓栓塞性疾病提供理论依据。

促血管生长因子联合干细胞移植为代表的血管新生治疗是治疗动脉缺血及静脉血栓最有前景的方法。PDGF-D是PDGF/VEGF家族最新成员，我们拟联合应用两种方式对大鼠后肢缺血及静脉血栓血运重建作用及其机制展开研究。首先我们成功分离EPC，通过CD34、CD133、VEGFR2以及FITC-UEA-lectin and Dil-acLDL进行鉴定，而后评估了重组PDGF-D对EPC生物学活性的影响，采用QPCR检测EPCs相关生长因子mRNA表达以及WB检测了相关通路蛋白表达，显示PDGF-DD能显著增强EPC增殖、迁移、粘附、分化及管腔形成能力，同时具有抗凋亡及抗衰老作用，其过程伴随VEGF，HGF，PDGF-B等相关生长因子的协同效应并与多种细胞信号通路磷酸化有关。.第二部分我们成功钓取了目的基因，将其克隆到慢病毒载体LV5中构建了LV-PDGF-D，通过酶切及DNA测序对其准确性进行鉴定。然后将LV-PDGF-D转染到EPC中，通过WB和QPCR对PDGF-D蛋白及mRNA表达进行检测，转染成功后荧光显微镜下可见慢病毒能高效感染EPC，WB显示PDGF-D转染EPCs组PDGF-D蛋白表达较其他组显著增强，QPCR表明处理组mRNA表达相对值较对照组增加3.98倍。生物学活性检测表明目的基因能够在EPC中持续性稳定表达并发挥效应。.第三部分通过结扎股及隐动脉建立缺血模型，建模后注射LV-PDGF-D与其他处理组对比评估缺血后肢的血管新生情况。血流散斑及毛细血管密度测定显示EPC-LV-PDGF-D组显著高于其他各组。细胞学检测表明LV-PDGF-D转染可以增强EPC生物学活性及外周血EPC动员，WB及QPCR检测表明转染后的EPC可持续高表达PDGF-D及受体，动脉造影提示移植组缺血肌肉侧支血管建立更丰富，证实EPC与PDGF-D基因转染联合作用效果更加显著，两者在促进血管新生作用中有协同效应。第四部分成功建立下腔静脉血栓模型并行EPCs移植。荧光显微镜下可见阳性细胞位于血栓边缘和静脉壁。移植后第7d行WB测定结果及QPCR显示LV-PDGF-D转染EPCs移植组PDGF-D蛋白及mRNA表达量显著增加，且血栓溶解及血栓机化更加明显。这些结果均表明PDGF-C基因腺病毒转染联合EPCs移植可以通过促血管新生途径显著加快静脉血栓溶解、机化和再通过程.