猪源致病性松鼠葡萄球菌脱皮毒素（Exh）C对巨噬细胞功能的影响

近年来我国仔猪渗出性皮炎时有发生，对仔猪危害较大是影响仔猪成活率和经济效益的重要原因之一。本实验室从患有渗出性皮炎的仔猪心包液中分离到高致病性松鼠葡萄球菌（S.sciuri），并证实该菌是引起我国猪渗出性皮炎的新病原，该病原携带脱皮毒素（ExhC）以及四种耐药基因。由于S.sciuri能引起人类多种疾病，是医院院内感染的主要病原之一，研究该病原的致病机理具有重要的公共卫生意义。该项目重点研究ExhC的活性和致病作用，利用PCR技术从S.sciuri基因组DNA中克隆ExhC基因，构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达，经亲合层析纯化后，通过细胞培养和乳鼠皮下注射试验检测其生物学活性，以小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7巨噬细胞为模型，分析该毒素对巨噬细胞吞噬、清除病原和产生炎性细胞因子的影响，揭示该病原逃逸先天性免疫应答造成感染的分子机制，为全面了解葡萄球菌的致病机理提供依据。

猪渗出性皮炎（EE）是一种由葡萄球菌引起的条件性疾病，尤其是在饲养与卫生条件差的养猪场容易爆发，影响仔猪成活率和养猪业的经济效益。本实验室从患有仔猪渗出性皮炎的仔猪心包液中分离到高致病性松鼠葡萄球菌（S.sciuri），并证实该菌是引起我国猪渗出性皮炎的新病原。该病原携带脱皮毒素（ExhC）C以及四种耐药基因，由于S.sciuri能引起人类多种疾病，是医院院内感染的主要病原之一，因此研究该病原的致病机理具有重要的公共卫生意义。该项目重点研究ExhC的活性和致病作用，利用PCR技术从S.sciuri基因组DNA中克隆ExhC基因，构建原核表达载体在大肠杆菌中表达，经亲合层析纯化后，通过细胞培养和乳鼠皮下注射试验检测其生物学活性，同时以小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7巨噬细胞为模型，分析该毒素对巨噬细胞吞噬、清除病原和产生炎性细胞因子的影响。研究结果表明，ExhC是致病性松鼠葡萄球菌携带的唯一的脱皮毒素。发现ExhC在自然条件下以二聚体的形式分泌；经大肠杆菌表达的his-ExhC融合蛋白具有良好的生物学活性，引起哺乳动物细胞死亡（necrosis）和乳鼠脱皮；而引起细胞死亡的区域位于79-128aa之间，而识别该区域的单克隆抗体完全可以中和ExhC引起的细胞死亡和乳鼠脱皮作用。进一步研究发现，ExhC分子有三个关键氨基酸（H107, D156 or S231），一点突变技术替换其中的任何一个氨基酸都会使突变体ExhC失去了引起细胞死亡的作用，然而对乳鼠脱皮没有影响。此外，研究发现，低浓度的ExhC明显抑制巨噬细胞的吞噬作用，同时诱导巨噬细胞产生大量的IL-6、IL-12、TNF、NO等促炎性反应因子，这可能是高致病性松鼠葡萄球菌（S.sciuri）引起细胞因子风暴导致动物死亡的原因。这些研究成果揭示该病原逃逸先天性免疫应答造成感染的分子机理，为全面了解葡萄球菌的致病机理提供依据。