传染性法氏囊病病毒蛋白VP5与靶蛋白VDAC2相互作用引起细胞凋亡分子机理的研究

Infectious Bursal Disease (IBD) is an acute, highly contagious and immunosuppressive avian disease caused by IBD virus (IBDV). IBDV infection causes severe damages in Bursa of Fabricius as target organ, leading to deep immunosuppression in hosts that increases their susceptibility to secondary infections. Although IBDV-induced host cell apoptosis has been established, the underlying molecular mechanism is still unclear. Based on our previous report that IBDV VP5 via interacting with the voltage-dependent anion channel 2 (VDAC2) induces apoptosis associated with facilitation of IBDV dissemination in host cells, we further investigate the molecular mechanism underlying VP5-VDAC2 interaction and determine the crucial amino acids and binding affinity (Kd) for such interaction, searching for the molecules recruited to VDAC2 and examining the involvement of BAK and Bid in VP5-induced apoptosis. This project will further our understandings of the role of VP5 in IBDV-induced pathogenesis and provide rationale to the formation of theory in explanation of IBDV-induced apoptosis, and also help to elucidate the pathogenesis of other pathogens.

摘要：鸡传染性法氏囊病（IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的鸡的一种急性、高度传染性和免疫抑制性疾病。由于IBDV感染严重损伤靶器官（鸡的法氏囊），致使病鸡存活后出现严重的免疫抑制，容易继发感染多种疾病。然而，IBDV如何引起细胞凋亡和免疫抑制的分子机理还不清楚。我们在前期的研究中，通过酵母双杂交以及免疫沉淀技术发现IBDV VP5通过结合宿主细胞靶蛋白VDAC2诱导细胞凋亡、促进病毒扩散。在此基础上，我们开展该课题的研究，进一步探索VP5与VDAC2结合的分子机理，研究VP5与VDAC2相互作用的关键氨基酸位点、测定VP5与VDAC2结合的亲合力(Kd)以及确定VP5与VDAC2互作信号传递的接头分子，并验证BAK与Bid是否参与VP5诱导的细胞凋亡过程，深入解析VP5在IBDV致病机理中的作用，为揭示IBDV引起细胞凋亡的机理提供依据，也为其他病原致病机理的研究提供参考。

该课题在前期研究的基础上，进一步确定IBDV VP5是诱导宿主细胞凋亡的重要蛋白。我们通过分子生物学技术进行VP5截断和多个位点的点突变并检测这些突变体在诱导细胞凋亡中的作用。研究发现，VP5诱导细胞凋亡的功能域主要位于N端前1-10aa，而其中的第３位丝氨酸(3S)突变后，VP5失去了诱导细胞凋亡的作用，说明该氨基酸是诱导细胞凋亡的关键氨基酸位点，该结果为进一步设计和研发无毒力的疫苗奠定了基础，具有重要的理论指导意义。此外。我们以VP5的靶蛋白VDAC2为诱饵，通过酵母双杂、免疫沉淀以及共聚焦显微镜发现并证实RACK1是VDAC2接头靶蛋白，而RACK1与VDAC2以及VP5共同形成复合物，VDAC2与VP5的1-50aa结合，而RACK1与VP5的100-145aa区域结合，复合体位于线粒体上。进一步研究表明， RACK1是一种抗细胞凋亡的分子，过表达RACK1显著抑制IBDV引起的细胞凋亡，而沉默RACK1表达抑制IBDV的复制，说明RACK1在抑制细胞凋亡中发挥重要作用。由于VP5与VDAC2结合属于动态结合，我们通过受体与配体结合测定表示其亲和力的解离常数（约为Kd=1.6 X 10的-8次方）,为深入解析VP5与多分子互作的生物学效应奠定了基础。由于BAK与Bid是内源性细胞凋亡途径中的重要蛋白，我们通RNAi技术沉默BAK与Bid在宿主细胞中的表达并检测两种分子对VP5诱导细胞凋亡的影响，结果发现，这两种分子沉默表达后不影响VP5诱导的细胞凋亡，说明BAK与Bid未参与VP5诱导的细胞凋亡过程，进一步明确了VP5诱导的细胞凋亡途径是通过细胞色素C的释放而不涉及BAK或Bid参与的分子机制，为进一步深入研究VP5引起的细胞凋亡的精确分子机理提供了参考。. 我们还发现VP5与HSP70互作。我们以pEGFP-vp5、pRK5-flag-hsp70、pEGFP-vdac2三种质粒共转染细胞后发现，HSP70与VP5以及VDAC2形成复合物,为进一步解析HSP70作为复合物中的一种蛋白分子的生物学开辟了研究方向。我们在IBDV VP5蛋白功能研究中还发现VP4与GILZ互作抑制I型干扰素的表达，抑制先天性免疫力，该发现为深入研究IBDV免疫抑制的分子机理打开了一个窗口，也为研制新型疫苗提供了理论指导