基于亚细胞定位和靶向抑制内源贮藏蛋白增强重组蛋白在大豆种子中高效累积机制的研究

Soybean seeds possess unique advantages as an expression host for the production of plant-derived recombinant pharmaceutical proteins. However, a relatively low-level expression of recombinant proteins are frequently observed in soybean though its high accumulation capability of the storage proteins in seeds. Thus, it is of great interest to enhance expression and accumulation of recombinant proteins in soybean seeds and promote the application of the soybean seed-based production system. In this study, four fusion partners Oleosin、γ-Zein、ELP and HFB1 fused with GFP are utilized to investigate the effects of intracellular targeting in oil bodies, endoplasmic reticulum, protein storage vacuoles or protein bodies on the accumulation and stability of the recombinant proteins. In addition, targeted inhibition of the soybean native storage proteins is carried out to determine whether the decreased storage proteins can enhance accumulation of the foreign protein in soybean seeds. To further confirm the concept, we use a pharmaceutical protein interleukin IL21 as model molecule to demonstrate the sensitivity of the recombinant protein expression to the subcellular localization as the soybean native storage proteins are inhibited. Our purpose is to increase our understanding of the recombinant protein accumulation mechanism in soybean seeds and to establish a viable soybean seeds-based system for the production of high-value plant-derived recombinant proteins.

利用大豆种子生产重组药用蛋白具有独特的优势，但外源重组蛋白在蛋白质合成和积累能力极强的大豆种子中的表达水平却较低。如何有效提高重组蛋白在大豆种子中的表达效率，充分发挥其独特优势，是大豆种子生物反应器研究与应用中的关键问题。本研究通过亚细胞定位和载体蛋白分子融合策略，系统研究外源重组蛋白在大豆种子油体、内质网、蛋白储藏液泡或蛋白体中的定位对其表达水平和稳定性的影响。通过RNAi干扰技术靶向抑制大豆种子内源贮藏蛋白的表达，研究大豆内源蛋白合成的抑制对外源重组蛋白表达水平的影响。在此基础上，以白介素IL21作为模式蛋白，进一步验证在靶向抑制大豆内源贮藏蛋白表达情况下，亚细胞定位或载体蛋白分子融合对提高重组蛋白IL21表达水平的作用。阐明重组蛋白在高蛋白作物-大豆种子中的高效累积机制，建立一套高效、稳定的大豆种子生物反应器技术体系，为加快植物源重组药用蛋白的生产与应用提供一个新的技术途径。

针对大豆种子中外源重组蛋白表达效率低（<1%），分离纯化困难等关键问题，本研究采用载体多肽融合和内源储藏蛋白靶向抑制策略，系统研究大豆内源蛋白合成抑制和重组蛋白定位表达对其在大豆种子中积累的影响。结果表明，重组蛋白zein-GFP、GFP-ELP和HFB1-GFP主要以可溶性单体形式在蛋白体或蛋白储藏液泡中积累。在成熟大豆种子中，zein-GFP和GFP-ELP积累水平（1.8%TSP和0.84%TSP）较对照未融合蛋白GFP提高3.91和1.82倍，但重组蛋白的积累并没有影响大豆种子总蛋白含量。表明载体多肽促进重组蛋白在细胞中的定位表达，显著增强重组蛋白在大豆种子中的积累。在靶向抑制内源主要储藏蛋白基因（Gy1—Gy5或Cgy1—Cgy3）表达情况下，zein-GFP在成熟大豆种子中表达水平为3.49%TSP（zein-GFP-Gyi）和4.49%TSP（zein-GFP-Cgyi），较未融合蛋白GFP（1.53%TSP）提高2.28倍和2.93倍。HFB1-GFP表达水平为4.64%TSP（HFB1-GFP-Gyi）和5.03%TSP（HFB1-GFP-Cgyi），较未融合蛋白GFP分别提高3.03倍和3.28倍。GFP-ELP表达水平为4.31%TSP，较未融合蛋白GFP提高2.82倍。表明内源储藏蛋白基因抑制进一步增强外源重组蛋白在大豆种子中的积累，但不同大豆内源基因Gy1—Gy5或Cgy1—Cgy3的抑制表达对重组蛋白的积累水平差异不显著。以药用蛋白-白介素IL21作为模式蛋白，构建携带Gyi反向重复片段的IL21融合基因表达载体。ELISA检测结果表明，融合蛋白zein-IL21在未成熟大豆种子中表达量为0.9-1.9%TSP，在成熟大豆种子中表达量为1.9-2.5%TSP，但种子总蛋白含量没有显著变化。本研究基于载体多肽融合与内源储藏蛋白靶向抑制策略，建立了高效大豆种子反应器技术平台，为后期植物源重组药用蛋白的生产与应用提供新的技术途径。