乳杆菌胞壁蛋白酶的多态性及其合成的营养调控

本项目将对从酸马奶、酸牛奶、酸驼奶及乳饼等传统发酵乳制品中分离出来的嗜酸乳杆菌等乳杆菌属菌株之胞壁蛋白酶进行分离纯化，研究并确定它们的类别属性、活性、相对分子质量、动力学常数、不同金属离子对其活性的影响、最适温度及温度稳定性、最适pH及pH 稳定性，以及对β-酪蛋白、αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白的水解能力和水解产物的抗氧化、抑制ACE等功能活性，并探讨培养基中氨基酸和肽等营养组分的类别及其含量对菌株合成胞壁蛋白酶的影响，解明其合成的营养调控机制。进行这方面的研究，为利用我国丰富的乳酸菌资源，筛选高蛋白酶活性的乳酸菌菌株及开发高活性乳酸菌蛋白酶打下基础，也为利用优质乳酸菌开发功能发酵乳制品及乳蛋白源功能因子提供理论依据。

分离嗜酸乳杆菌CEP最佳条件：裂解液(50mMTris-HCL，100mMNaCl，1%(v/v)Tirtonx-100，1.5mg/ml溶菌酶，20ml/g菌体浓度，37℃保温3h。CEP纯化方法为PEG-20000浓缩，超滤去除Tritionx-100，40-60%硫酸铵分段盐析，Sephacryl-S-300HR层析，Native-PAGE切胶回收得纯酶。其分子量28.3KDa，比酶活力62.07U/mg，最适温度和pH为32℃、6.5。Co2+、Mg2+、Ca2+对其有激活作用，Zn2+、Ni2+、EDTA、PMSF对其有显著抑制作用。超声波提取发酵乳杆菌CEP最佳条件：细胞浓度0.06g/mL，破碎功率336.18W，时间28.63min。经0-60%硫酸铵分级沉淀、SephacrylS-300HR层析、Native-PAGE割胶回收得到纯CEP。其分子量32.5kDa，最适温度和pH为41℃、8.0。Mg2+，Co2+，Ca2+对其有激活作用；Zn2+、Ni2+、PMSF、EDTA对其有显著抑制。菌体用含有30mMCaCl2的50mMTris-HCl缓冲液洗涤，再用含有45mMEDTA-Na2的50mMTris-HCl缓冲液悬浮，43℃保温90min后离心得粗酶液。再经DEAESepharoseCL-6B纯化得分子量40kDa的瑞士杆菌CEP。N端氨基酸序列Gln-Ile-Ile-Th-Asp-Ile-Tyr-Ala-Arg-Glu，其Km为0.115mM，最适温度和pH为33℃、6.0，Ca2+能激活其活性，PMSF对CEP有抑制作用。通过DEAE-SephadexA-25和SephadexG-100柱层析，得到了干酪乳杆菌CEP。干酪乳杆菌CEP水解酪蛋白产生ACE抑制肽分别来源于αs1-酪蛋白的95-105、106-115、148-166片段。乳糖和动物蛋白胨对CEP的产生有显著促进作用。在MRS培养基中添加K2HPO42.78g/L，柠檬酸二铵2.92g/L和乙酸钠4.36g/L时，得酶活11.36U/mL，比MRS培养基提高了63.68%。在MRS中添加0.1g/L的精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺，CEP的活性从6.94U/mL提高到11.11U/mL；添加酶水解的鸭肉蛋白多肽时，酶活力提高到13.89U/mL。