海洋源嗜酸乳杆菌肽聚糖的免疫调控效应及其信号机制

In this topic, we will study the purification methods of L. acidophilus peptidoglycan (PG), analysis its chemical components and structure, exploit structure modification ways of PG to enhance its solubility and immune activity, discuss the protection effect of PG on intestinal mucosa of mice infected with pathogenic Escherichia coli. As well as, the regulation function of PG on rat peritoneal macrophages will be evaluated by detection the proliferation and phagocytic activity, the levels of nitric oxide ( NO), TNF-α, interleukin 1, interleukin 6, and interleukin 12 produced by mice peritoneal macrophages after stimulated by PG. Further, we want to explore the signal mechanisms of PG activating macrophages by investigating the effects of PG on the pathway of PKC→NF-κB and PKC → ERK1/2→AP-1 and the transcription of TNF-α mRNA of rat peritoneal macrophages by evaluation the affection of PG on NF-κB activity, protein expression of phosphorylation of ERK 1/2 as well as IκBa and TNF-α mRNA, NF-κB and AP-1 DNA binding activity after the macrophages stimulated by PG. It could provide evidence for exploiting the using of L. acidophilus peptidoglycan in meiicine, and fish feed as well as function food as immune augment by underway the present research.

对来源于海洋浮游生物肠道之嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖的分离方法进行研究，建立高效的分离方法，分析其化学组成及结构；对其分子结构进行修饰，以提高其水溶性和免疫调节活性，探讨其安全性及对感染致病性大肠杆菌小鼠肠黏膜的保护作用效应。并以小鼠腹腔巨噬细胞为模型，通过研究其对巨噬细胞增殖、吞噬活性、释放免疫效应分子NO、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12等的影响，评价其对巨噬细胞的免疫调节活性。通过研究嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖对巨噬细胞信号分子NF-kB活性、IkBα蛋白、磷酸化ERK1/2蛋白和细胞因子TNF-α mRNA表达以及NF-kB和AP-1与DNA结合活性的影响，观察其对大鼠腹腔巨噬细胞PKC→NF-kB及PKC→ERK 1/2→AP-1通路的影响，探讨其激活巨噬细胞的信号机制，揭示肽聚糖激活巨噬细胞的本质，为嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖应用于药品和水产动物饲料及功能性食品提供理论依据

乳酸菌作为一类重要的肠道定植型益生菌，被广泛的应用于发酵食品中，尤其是酸乳，干酪，泡菜等。同时，关于肠内乳酸菌与宿主健康的密切关系，也越来越多的被国内外微生物学家阐述。肽聚糖（peptidoglycan, PG）作为一种免疫增强剂，对其在诱导有关免疫调控因子(NF-κB) 的释放来刺激免疫系统发挥其抗感染、抗肿瘤等生物效应方面的研究已初见端倪，但其激活巨噬细胞的具体信号通路仍不清晰，它在免疫系统中的作用机理也有待进一步探索。.本项目通过对来源于海洋鱼类肠道中的乳酸菌进行筛选，获得一株高DPPH清除率嗜酸乳杆菌菌株，并对其胞壁肽聚糖进行提取及功能研究。通过HPLC分离，红外质谱分析及核磁氢谱验证，结果表明嗜酸乳杆菌细胞壁肽聚糖结构单体为NAG-(β-1,4)-NAM-L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala，分子量为875.260道尔顿。采用混合磷酸盐（5％三聚磷酸钠，2％三偏磷酸钠，pH=6.0）对最优酶解工艺条件下制备出的小分子肽聚糖进行修饰，得到磷酸化肽聚糖，及采用硝酸催化肽聚糖与亚硒酸钠制备硒化肽聚糖，并研究硒化肽聚糖的相关特性。PGN聚合物，PGN水解产物以及PGN单体成分对LPS引起的炎症反应具有较好的抑炎调节功能。磷酸化肽聚糖能显著增加IL-1α，TNF-α以及GM-CSF这三个因子的分泌；硒化前后的抗氧化性及抗肿瘤特性有显著提高。在对巨噬细胞中NF-κB和MAPK激酶途径的相关研究中，发现肽聚糖单体成分NAM的抑制作用是通过p38-MAPK激酶通路，抑制NF-kB的核转录，限制炎症因子的表达来实现的。在进一步的研究中，我们利用系统蛋白组学的研究方法，同位素相对标记与绝对定量（iTRAQ）技术发现了钙信号途径与p38-MAPK途径的相互关系。钙信号调节蛋白，通过上调内质网Ca2+-ATP酶（SERCA）在NAM处理组的表达，调节与内质网上SERCA依赖的钙离子流动方向，进而实现NAM介导的抑炎活性发挥作用。在对感染大肠杆菌小鼠肠黏膜的保护作用研究中，小鼠肠道免疫切片的结果证明嗜酸乳杆菌PG及其单体成分NAM确实可以对小鼠肠道起到很好的抑炎作用。选择性氧化修饰的肽聚糖可显著拮抗由环磷酰胺所致免疫损伤小鼠的脾指数、胸腺指数下降效应，选择性氧化修饰的肽聚糖具有调节免疫损伤小鼠免疫功能的作用。通过肽聚糖对感染致病性大肠杆菌小鼠肠黏膜分泌性免疫球蛋白(SIg