AI-2/LuxS群体感应系统介导乳杆菌S-层蛋白合成的效应研究

Screening lactobacillus with good intestinal adhesion function, and confirm that lactobacillus genome exist AI-2/LuxS QS system or not by detection AI-2 production and lux S gene expression in lactobacillus with the method of Vibrio harvey BB170 bioluminescent reporting system. Clone and analysis the sequence of S-layer protein gene of screened lactobacillus with good adhesion function and AI-2/LuxS QS system. For illuminating the regulation effects of AI-2/LuxS QS system on S-layer production, construction the strains of lactobacillus with lux S gene deletion, validation the level of luxS genes expression and AI-2 production, and compare the level difference of S-layer protein and its gene transcription of wild strains, lux S gene deletion strains and lux S gene deletion strains added with AI-2. Establishing composite nanometer immunosensor for high sensitive and rapid quantitative detection of S-layer protein，preparation antibody of S-layer protein and compound nanometer sensor using grapheme or nanogold and so on, then fixed the S-layer protein antibody on the surface of composite nanometer sensor with the methods of physical and chemical modification, such as the methods of adsorption and covalent bonding. Provide technical support for rapid screening of functional lactobacillus and developing its using in functional fermentation dairy products.

筛选肠道黏附性好的乳杆菌，采用哈氏弧菌BB170生物发光报告系统检测其AI-2合成及lux S基因的表达情况，确定其基因组是否存在AI-2/LuxS QS系统；同时对黏附性能好、存在AI-2/LuxS QS系统的目标乳杆菌的S-层蛋白基因进行克隆、序列分析；构建lux S 基因缺失菌株，验证luxS基因的表达量及AI-2产生量，并且比较野生株、缺失株及缺失株回补AI-2的S-层蛋白表达量差异，S-层蛋白基因的转录水平差异，以此阐明AI-2/LuxS 调节的QS 系统对S-层蛋白合成的调控效应；同时制备S-层蛋白的抗体，利用石墨烯/纳米金等制备复合纳米传感器，通过吸附法、共价键法等物理或化学修饰方法，将S-层蛋白抗体固定在复合纳米传感器表面，建立S-层蛋白复合纳米免疫传感器，实现S-层蛋白的高灵敏、快速定量检测,为快速筛选功能性乳酸菌用于功能性发酵乳制品开发提供技术支撑.

群体感应系统参与乳酸菌的益生功能，如细菌素的合成、肠道细胞黏附和定殖能力等。乳酸菌S-层蛋白也与肠道黏附性相关，但是还未有关于AI-2/LuxS QS系统介导S-层蛋白合成的研究报道。本研究筛选肠道黏附性能较好的乳杆菌，采用 Vibrio Harvey BB170 (哈氏弧菌)生物发光报告系统检测乳杆菌中AI-2，lux S基因的表达情况；添加呋喃酮作为抑制剂来研究AI-2/LuxS QS系统对乳杆菌黏附性能的影响；同时制备S-层蛋白的抗体，建立S-层蛋白复合纳米免疫传感器，实现 S-层蛋白的高灵敏、快速定量检测，为快速筛选具有肠道黏附性能的乳酸菌用于功能性发酵乳制品的开发提供简便的方法。.检测发现嗜酸乳杆菌CICC6074能够产生具有活性的AI-2信号分子，随着菌体的生长AI-2分子的活性也随之增加，在对数中期达到最大值。成功构建luxS基因表达载体pUS460，使其能够在嗜酸乳杆菌CICC6074中表达。LuxS蛋白表达量的上升引起了S-层蛋白表达量的上调。.用阳极氧化法制备单层膜多孔硅，通过微流控技术结合，利用A蛋白将S层蛋白单克隆抗体定向固定于二氧化钛修饰的多孔硅表面制备传感器。用该传感器对S-层蛋白粗提液检测，结果表示光学厚度有明显的增加，通过线性方程可计算得出粗提液中S-层蛋白的浓度。将粗提液检测后的洗脱液进行SDS-PAGE分析，得到一条单一的目标条带，说明多孔硅表面的抗体对S-层蛋白发生了特异性吸附，检测过程中排除了杂蛋白的干扰。该传感器对S-层蛋白的最低检测限为1ng/mL，响应时间在5min左右，实现了对S-层蛋白的灵敏、快速检测。.利用呋喃酮C-56作为AI-2/LuxS QS系统抑制剂进行转录组分析，结果发现呋喃酮C-56的添加会导致115个基因表达差异显著，其中63个基因下调，52个基因上调。将这些差异基因归类分析，我们发现呋喃酮C-56会显著抑制PTS，黏附因子以及黏附表层蛋白的下调。推断AI-2/LuxS QS系统可以通过调节PTS，双组分调节系统，纤连蛋白结合蛋白FbpA和S层蛋白介导嗜酸乳杆菌的粘附。