磁性纳米二氧化钛颗粒固定化漆酶的分子设计与调控

To solve the limitation of electron transfer between substrate and enzyme in the laccase-catalyzed oxidation, the system of laccase immobilization onto the magnetic titania nanoparticles was constructed in this project. Based on the principle of electron transportation, laccase catalysis and titania photocatalysis were organically combined in order to accelerate the electron transfer in the catalytic oxidation process. This system possessed some good properties such as fast oxygen reduction of laccase and good electron donating ability of titania photocatalysis. Steady and presteady state kinetics were studied for the oxidation catalyzed by the immobilized laccase. A particle-based mesoscopic model was used to investigate the reactive dynamics by molecular dynamics simulation. These results revealed the mechanism of electron transfer during the oxidation reaction of the titania-laccase system and the regulation principle for molecular design and catalytic oxidation of this system was also achieved. Microscopic oscillation combined with rotation happened to the magnetic nanoparticles in an alternating magnetic field. It is beneficial for the avoidance of particle aggregation, strengthen of mass transfer and enhancement of catalytic efficiency. In addition, the immobilized laccase on the magnetic titania nanoparticles were applied in the fluidized bed with an alternating magnetic field. This project had some advantages including high mobility and reactive efficiency of immobilized enzyme at nano meter scale, energy conservation and environmental protection of photocatalysis, improvement of mass transfer and easy particle recovery by external magnetic field. A high-efficient and environment-friendly biocatalysis process was established in this project. It laid a foundation for the industrial application of magnetic nano-materials in large scale.

针对漆酶催化氧化过程中底物与漆酶间电子传递受限的问题，本课题基于漆酶催化氧化和二氧化钛光催化的电子传递原理，结合漆酶分子氧还原速率快和二氧化钛光催化供电子能力强的双重优势，构建磁性纳米二氧化钛固定化漆酶体系，加速生物催化氧化过程的电子传递。通过稳态和前稳态动力学分析以及介观分子动力学模拟，确立了磁性纳米二氧化钛固定化漆酶催化氧化过程中的电子传递机制，获得了磁性纳米二氧化钛-漆酶固定化体系的分子设计和催化反应调控的原则。利用磁性纳米载体在交变磁场中的微观自旋转耦合振动，解决磁性纳米颗粒的团聚问题，增强传质，提高催化效率，并将交变磁场流化床应用于磁性纳米二氧化钛固定化漆酶的催化氧化反应。本课题兼具纳米固定化酶高运动性和高反应效率的优势、光催化节能环保的特点及外加磁场强化反应过程传质和方便回收利用的特色，其研究成果创立了高效环境友好的生物催化过程，为磁性纳米材料大规模工业化应用奠定了基础。

本项目利用二氧化钛光催化供电子能力强和漆酶分子氧还原速率快的双重优势，解决了水中分子氧与二氧化钛表面电子的结合慢和漆酶催化氧化过程中底物与漆酶间电子传递受限的问题，制备了能够加速电子传递的磁性纳米二氧化钛固定化漆酶，同时建立了交变磁场辅助的酶催化装置，加速反应速率，提高催化剂使用寿命。为了实现研究目标，本项目首先进行了用于磁性纳米固定化酶的高纯漆酶的制备；通过多种调控手段的研究，漆酶的表达量提高1倍以上；结合磁性纳米亲和吸附载体的合成以及磁稳定流化床的应用，制备了回收率为108.9%、纯化倍数为62.4倍的漆酶。在此基础上，本项目进行了磁性纳米二氧化钛亲和吸附载体的合成和表面修饰，其粒径为170 nm，表面螯合铜离子；以此为固定化载体，漆酶的最佳吸附量为38.9 mg/g载体，酶活回收率为60.8%；磁性纳米二氧化钛固定化漆酶在pH和温度适用范围及热稳定方面均优于游离漆酶。磁性纳米二氧化钛固定化漆酶对不同酚类化合物光酶复合催化降解的结果表明，最适pH在4-5范围内，最适温度在25-35℃范围内，过高或过低的底物浓度对降解是不利的；催化动力学的研究表明，同等用量条件下，磁性纳米二氧化钛固定化漆酶比同时使用磁性纳米TiO2和磁性纳米二氧化硅固定化漆酶的催化初速度提高51%，达到完全降解所需时间减少一半；对中间产物超氧阴离子自由基的分析显示，该体系超氧阴离子自由基的含量比同时添加两种催化剂的体系减少55%，该结果表明通过磁性纳米二氧化钛固定化漆酶体系的构建，其催化氧化过程中的电子传递路径发生了改变，并提高了电子传递速率，改善了催化能力，达到了预期的结果。磁性纳米固定化漆酶在交变磁场辅助的酶反应装置中对苯酚的降解能力较常规振荡反应提高100%以上，达到完全降解时所需固定化酶的用量较振荡反应减少一半，重复使用10次，仍能保持80%以上的降解能力，有效提高了固定化酶的使用寿命。本项目研究成果为固定化酶催化氧化还原反应时提高电子传递速率提供了一种有效手段和新思路，具有很好的示范作用；交变磁场辅助的酶催化装置为磁性纳米材料在生物催化中的应用提供了一个高效平台，具有较好的应用前景。