CD47和Band3介导的衰老红细胞吞噬机制的单分子定位成像研究

Red blood cells (RBCs) aging has always been a research focus in medical immunology. As a “marker of self”, CD47 function as a phagocytic inhibitory signal on normal cell, but a phagocytic promoting signal on senescent RBCs. During RBCs senescence, Band3 breaks down, generates senescent cell antigen, and initiates complement C3 fragments mediated phagocytosis. CD47 and Band3 form a macro-complex on human RBCs, while their relationship on mouse RBCs is still not known. During RBCs senescence, the coordination between Band 3 and CD47, and their related phagocytosis signal pathway convertion, still needs further investigation. Our preliminary work found that, comparing with young mRBCs, CD47 formed bigger clusters on aging mRBCs and phagocytic inhibitory signals eliminated. In this study, we will explore the spatial organization of CD47/Band3 at nano-scale using direct stochastic optical reconstruction microscopy. By dissecting the spatial organization of CD47/Band3 on young/aging human/mouse RBCs and their related phagocytosis signal pathway, our work will elucidate the phagocytic mechanism of aging RBCs, and provide new prospects in understanding of nucleated cells aging and related diseases.

红细胞衰老一直是医学免疫学的研究热点。正常红细胞中发挥抑制吞噬功能的膜蛋白CD47，在衰老红细胞中可能起着促进吞噬的作用。红细胞衰老过程中，Band3蛋白断裂、簇集，形成衰老抗原，通过补体途径促进吞噬。人红细胞表面CD47/Band3呈蛋白复合体形式存在，老鼠红细胞中二者关系尚不明确。细胞衰老时，CD47和Band3如何协调二者的吞噬信号尚有待深入研究。申请人利用dSTORM成像发现：同年轻的老鼠红细胞相比，CD47在衰老的红细胞表面呈簇状分布。此时，CD47/SIRPα传递的吞噬抑制性信号消失。本课题以年轻/衰老的人/鼠红细胞为材料，通过dSTORM成像分析CD47/Band3的空间组装变化，同时检测二者下游的磷酸化信号，从而揭示CD47/Band3空间组装和信号途径转换之间的关系，为阐明衰老红细胞的清除机制提供线索，进而为有核细胞的衰老及红细胞衰老相关疾病的研究提供参考。

CD47分子是SIRPα 的配体和血小板反应蛋白TSP1的受体。先前研究表明老化红细胞的清除是有CD47表达的下降和TSP-1结合增加导致。然而，为什么CD47表达下降，而其与TSP-1的结合却能够增加，机制依然不清楚。借助于随机光重构显微镜（dSTORM）和定量分析，我们发现正常小鼠的红细胞表面CD47呈纳米簇分布，与TSP-1几乎不结合。我们也证明了虽然衰老红细胞表面CD47水平显著下降，它与TSP-1的结合依然增加。双色dSTORM成像揭示，在衰老红细胞表面与TSP-1孵育后，CD47可以形成大簇。值得注意的是，脂筏的重新定位参与了衰老红细胞表面TSP-1诱导的CD47的高阶重组。我们进而对造血谱系中造血干细胞和T细胞表面的CD47分子进行了dSTORM成像，在造血干细胞表面CD47也存在明显的大簇；培养的T细胞中，基底层外围的CD47分子呈大簇分布；中心区域的CD47呈小簇分布；其顶层的CD47分子呈大簇分布。我们推测TSP-1诱导的CD47分子与自身或其他配体的侧向相互作用也存在于其他细胞中，比如CD47与Fas 受体、VEGFR、CD36或整合素等，进而起始了相关的信号转导。本项目为红细胞衰老过程中，脂筏参与的TSP1诱导的CD47重组、膜皱缩等整体变化提供了直接的形态学证据。