新型磁性“纳米分子笼”的设计及其强化固定化酶性能研究

Biocatalysis is a green and sustainable technology, and the development of high efficiency enzyme immobilization method remains a challenge. In the process of enzyme immobilization, maintaining the activity of enzyme, enhancing its stability and improving the mass transfer is the key to strengthen the performance of immobilized enzyme. In view of this challenge, this project proposes the design of new magnetic “nano molecular cages” to strengthen the performance of immobilized enzyme. The core is: “nano molecular cages” are constructed on the magnetic microsphere surface by using graphene oxide and other crosslinkers to crosslink polymer chains. Consequently, enzyme molecules are immobilized via cage encapsulation instead of covalent bond. In this way, not only the natural active conformation of enzyme can be maintained to maximum extent, but also the denaturation and inactivation of enzyme can be inhibited by “nano molecular cage”. Besides, molecular cage structure can improve the mass transfer efficiency. This project will systematically study the influences of the structural parameters of “molecular cage” on enzyme conformation transition, enzyme activity, enzyme stability, and mass transfer kinetics, as well as the effect of graphene oxide on the enzyme. The influence rule and molecular mechanism of nanoscale microenvironment on enzyme activity and stability will be scientifically interpreted. Based on this, a new immobilized enzyme with high activity and good stability will be prepared, which strengthens the enzymatic performance. After that, the immobilized enzyme will be used to catalyze synthesis of some important chemical products such as benzyl cinnamate. This research will develop the scientific cognition of nano-space design method on the carrier surface and its influence on the structure and activity of enzyme. What’s more, this research will innovate the immobilization technology of enzyme, and promote the development and application of immobilized enzyme.

生物催化绿色可持续，开发高效酶固定化方法是其主要挑战之一。酶固定化中，维持酶的活性并提高其稳定性，同时降低传质阻力，是强化固定化酶性能的关键。针对此挑战，本项目提出设计新型磁性“纳米分子笼”强化固定化酶性能的研究构想。其核心是：利用氧化石墨烯等交联剂交联高分子链在磁性微球表面构建“纳米分子笼”，通过封装而不是共价键将酶固定，不仅可最大程度保持酶的天然活性构象，分子笼结构还可抑制酶变性失活，提升传质效率。系统研究“分子笼”的结构参数对酶构象转换、酶活、酶稳定性和传质动力学的影响，以及氧化石墨烯对酶的影响，科学阐释纳米尺度微环境对酶活性和稳定性的影响规律和分子机理。以此为基础，构建酶活性高、稳定性好的新型固定化酶，强化酶催化性能，并应用于酶促合成肉桂酸苄酯等重要化工产品。本项目研究成果将发展载体表面的纳米空间设计方法及其对酶结构和活性影响的科学认知，创新酶固定化技术，推动固定化酶的发展和应用。

在工业操作中，游离酶的成本高、不可重复利用，限制了其进一步发展。为此，在保证酶活性的前提下，将游离酶进行固定化是解决上述问题的重要途径。酶固定化能够提高酶的稳定性，减少酶对产品的污染，实现酶的回收和重复使用，达到连续化操作、降低生产成本的目的，是近20年来生物技术领域关注的焦点之一。在理想的酶固定化技术中，酶既要与载体结合牢固，又要保留其活性构象，并增强酶稳定性，还要避免传质阻力降低酶的表观活性。因此，研究在不破坏蛋白结构的前提下提高其固载强度和稳定性具有重要学术意义和应用价值。针对此挑战，本申请提出构建新型磁性“纳米分子笼”柔性封装固定化酶强化酶催化性能”的研究构想。经过系统研究，取得如下成果：（1）利用柔性高分子链和交联剂在磁性微球表面成功构建了“纳米分子笼”结构。考察了不同高分子链及其接枝密度对“分子笼”的大小、结构和组成等参数的影响，并研究了交联剂长度、电荷性质、分子亲疏水性等以及交联剂的交联密度对“分子笼”大小和结构的影响，阐释了“分子笼”的形成机理；（2）研究了“纳米分子笼”对酶构象稳定性与催化活性的影响，考察了酶蛋白与“分子笼”的相互作用。分析了“纳米分子笼”中酶蛋白的构象变化与催化活性和稳定性的关系，阐释了“纳米分子笼”的结构参数影响酶构象、活性和稳定性的分子机理；（3）基于上述成果，优化制备了磁性“纳米分子笼”柔性封装固定化脂肪酶，其酶载量大、活性高、稳定性好。酶的固载量大于50 mg/g，活性高于游离酶。与游离酶相比，分子笼封装固定化酶对SDS和脲的耐受性分别提高6.6倍和2.5倍，热稳定性提高15.8倍，酸/碱环境稳定性分别提高9.6倍和6.6倍，且具有良好的重复使用性。研究成果发展了载体表面的纳米空间设计方法及其对酶结构和活性影响的科学认知，推动了固定化酶的发展和应用。共发表SCI学术论文5篇，其中中科院一区2篇，二区1篇。投稿5篇，申请专利1项。