PERK在胰腺酶噬发生中的作用及其信号通路机制研究

Zymophagy is defined as selective autophagy of zymogen granules in pancreatic acini, which degrades abnormally activated trypsinogen. Zymophagy is newly found endogenous protective mechanism in pancreas and was first reported by foreign researchers in 2011.Its mechanism is yet unclear now. Recently we adopted calcium ions-ATPase inhibitors,thapsigargin in pancreatic acini to induce endoplasmic reticulum stress and found the effects of zymophagy induced by bombsin had been enhanced with concurrent elevation of the expression of mRNA and protein of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase(PERK). These findings suggest that endoplasmic reticulum stress has regulating effects on zymophagy，which needs further study wheather the regulating effects is mediated by PERK or not. Using models of mice and AR42J acinar cells treated by bombsin with the strategy of loss and gain of function by siRNA, this project is planned to explore the roles of PERK and its signal pathway(elF2α-ATF4/CHOP and KEAP1-NRF2) in mediating zymophagy. The aim of this project is to elucidate the mechanism of zymophagy, which will be helpful to find new therapeutic targets for acute pancreatitis.

酶噬指胰腺腺泡细胞内酶原颗粒选择性自噬现象，具有降解异常激活的胰蛋白酶原作用，是一种新发现的胰腺内源性保护机制，首次于2011年在实验性急性胰腺炎模型中被发现，但其发生机制尚未阐明。近期我们采用Ca2+-ATP酶抑制剂诱导胰腺腺泡细胞产生内质网应激，发现可增强雨蛙素诱导的酶噬效应，并伴有内质网应激相关的蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）表达上调，这提示内质网应激参与酶噬的调控，但是否通过PERK信号通路介导尚待进一步研究。本课题拟以雨蛙素诱导的小鼠和稳定表达GFP-LC3融合蛋白的胰腺AR42J细胞为研究对象，采用电镜、免疫荧光、RT-PCR、Western blot等方法和技术，通过siRNA进行PERK基因功能获得和缺失实验，探讨PERK在酶噬发生中的作用及其下游信号通路机制（elF2α-ATF4/CHOP和KEAP1-NRF2），旨在阐明酶噬的发生机制，并探索急性胰腺炎新的治疗靶点。

酶噬是胰腺腺泡细胞内酶原颗粒的选择性自噬现象，具有降解异常激活的胰蛋白酶原的作用，是一种新发现的胰腺内源性保护机制。首次于2011年在实验性急性胰腺炎模型中被发现，同时有数据表明，急性胰腺炎中存在内质网应激反应。本课题建立稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞系，通过靶向干扰PERK基因，结合运用生物信息学、蛋白质生物化学、细胞生物学等方法与技术，对PERK参与急性胰腺炎自噬变化的分子机制进行了初步研究。首先通过雨蛙素诱导细胞急性胰腺炎的发生，观察AR42J细胞急性胰腺炎时酶噬的变化；然后建立AR42J细胞内质网应激模型，观察细胞变化及PERK在细胞中的表达。接着，利用慢病毒感染技术将EGFP-LC3 融合蛋白包装成慢病毒以感染至AR42J 细胞中，运用RNA interference干扰技术，构建靶向干扰PERK及Beclin1基因的真核表达载体，进而对慢病毒载体序列进行基因测序鉴定，建立稳定干扰PERK及Beclin1基因的AR42J-LC3细胞系。通过RT-PCR方法及Westernblot检测发现沉默Beclin1 基因影响急性胰腺炎中炎性因子水平及自噬的程度，且它对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型有明显的保护作用，而下调PERK可以减少LC3-I 向LC3-II转化、以及Beclin1 的表达。利用共聚焦显微镜及电镜观察自噬及酶噬变化，发现下调PERK后，在内质网应激状态下，胰腺炎中自噬体的形成也相对减少。本课题明确的探讨了PERK在酶噬中发生的作用，同时对于认识PERK家族成员之间的关系提供了重要的启示性线索。项目资助发表核心期刊文章2篇，SCI论文1篇。培养硕士生2名，并均已经取得硕士学位。