内质网应激及PERK信号通路在氟骨症发病机制中的作用

慢性氟中毒时成骨细胞怎样被激活、骨转换怎样被加速，是地方性氟中毒发病机制中亟待解决的关键问题。我们在前期工作中发现，染氟成骨细胞中与内质网应激相关的蛋白BiP、蛋白质二硫键异构酶、蛋白酶体26S ATP酶和硫氧还蛋白表达增多；氟骨症大鼠骨组织内质网应激相关基因的表达上调，为回答上述问题提供了新线索。本项目拟体外培养成骨细胞染氟并结合整体氟中毒动物实验，观察内质网应激引发的关键因子PERK及其下游ATF4和Nrf2等基因和蛋白水平的表达变化，分析其与成骨细胞增生、分化和骨形成间的相互关系，探讨内质网应激及PERK信号通路在氟作用下成骨细胞激活、骨转换加速中的作用；检测与成骨细胞增殖、分化等相关的调控因子的变化，阐明内质网应激通过哪些因素介导氟中毒骨病变的发生、发展。本项目的完成有助于发现以往氟骨症机制研究从未涉及的新的因子和信号通路的重要作用，为氟骨症防治策略提供新的思路和理论依据。

本项目按照实验计划完成实验内容，达到预期设想结果。实验成果至今已发表期刊学术论文8篇，其中SCI收录4篇，中文核心期刊收录4篇，尚有部分成果待发表；参加中华医学会主办学术会议2次并作大会报告1次和分组汇报2次。这期间培养博士研究生3名和硕士研究生2名。体内实验通过灌胃给氟复制氟骨症动物模型。骨病理形态、骨密度指标和骨组织成骨、破骨相关的基因分析结果证明大鼠呈骨吸收增强到成骨活跃的氟骨症骨转换加强的病变特征。氟骨症发生过程中伴随着内质网应激及未折叠蛋白反应，而且PERK信号因子的变化与氟中毒骨吸收增强具有一致性，下游因子Nrf2的变化与成骨因子变化相一致。投氟早期大鼠整体氧化应激水平在代偿范围，给高剂量氟后期大鼠出现氧化应激的失代偿。体外实验选取OS732细胞和MC3T3-E1细胞作为染氟成骨细胞模型。首先选择促进成骨细胞活性的氟浓度处理作用于OS732细胞，显示氟作用下成骨细胞以成骨方式为主，且抑制细胞的诱导破骨功能；同时引发细胞内质网应激并激活PERK、Nrf2信号通路。在此基础上选取MC3T3-E1细胞暴露于低、中、高浓度氟环境下。从低到高氟浓度作用成骨细胞后细胞活性变化呈双向效应。高剂量氟抑制细胞活性，却特异性刺激成骨细胞分化和成熟。不同剂量的氟均促进了细胞内PERK和其下游ATF4基因表达，而Xbp1和ATF6通路仅在低氟作用下被显著激活，说明内质网应激及未折叠蛋白反应参与了染氟诱发的成骨细胞双向效应机制。采用BiP 基因干扰（siRNA）联合染氟，各实验组细胞不仅PERK、Xbp1和ATF6等因子表达下降，而且细胞内成骨和破骨相关的关键转录因子表达明显减少，提示未折叠蛋白反应在氟刺激成骨细胞功能处于重要地位。利用PERK siRNA降低两种成骨细胞系PERK基因和蛋白的表达，结果显示成骨细胞分化标志物表达下降，且降低了成骨细胞诱导破骨功能。PERK/Nrf2信号通路在氟诱导成骨细胞活性和功能方面有着重要作用，在过量氟促进成骨细胞诱导破骨细胞分化方面中扮演着重要角色。