最适pH1.0的极端酸性β-甘露聚糖酶BMan5A的酸适性机制研究

β-甘露聚糖酶是一类能水解甘露糖苷键的半纤维素酶，可应用于饲料、食品、能源等诸多领域。饲料用甘露聚糖酶需要在强酸性条件下维持稳定并有效的发挥活性。极端酸性甘露聚糖酶的嗜酸分子机理研究，有助于拓展对生物大分子结构与功能的了解, 同时有望获得性能更为优良的酶。我们获得了两个真菌来源的甘露聚糖酶, 分别为最适pH最低（pH1.0）的强嗜酸甘露聚糖酶（BMan5A），和中碱性甘露聚糖酶（HMan5A）。它们序列一致性较高，作用pH范围互补。以该两个酶为核心材料，基于序列比对、同源建模和结构比对，通过DNA改组、模块拆分和重建等方法，分析寻找与酶酸适性相关的区域和结构模块。进而利用计算机辅助设计，对BMan5A进行定点突变，并将不同突变位点进行随机组合构建突变文库，分析寻找与酶酸适性相关的关键位点。为阐明其嗜酸机理提供依据，并为进一步的甘露聚糖酶及其它糖苷水解酶的pH适性改造提供理论基础。

β-甘露聚糖酶是一类能水解甘露糖苷键的半纤维素酶，可应用于饲料、食品、能源等诸多领域。饲料用甘露聚糖酶需要在强酸性条件下维持稳定并有效的发挥活性。极端酸性甘露聚糖酶的嗜酸分子机理研究，有助于拓展对生物大分子结构与功能的了解, 同时有望获得性能更为优良的酶。我们获得了两个真菌来源的甘露聚糖酶, 分别为最适pH最低（pH1.0）的强嗜酸甘露聚糖酶（BMan5A），和中碱性甘露聚糖酶（HMan5A）。以该两个酶为核心材料，通过交换功能域的模块，我们发现N端替换的重组子全部失活，可见N端序列对酶活性发挥起到了关键作用，pH改变明显的杂合子区域集中在Loop区，尤其是包含的区段6和区段9的替换，因此酶的柔性区，尤其是靠近催化氨基酸的区域是影响酶作用的pH值得一个重要因素。我们对Bman5A和Hman5A的模拟的三维结构进行了比对，结合序列比对我们选定了4个loop区。其中，Loop2和Loop4紧邻活性中心位点谷氨酸残基，对酶活性及pH影响较大，将Bman5A的序列替换到Hman5A后，使其最适pH向酸性方向移动了近2个单位。可见Loop区是决定酶的催化特性的关键区域。L322M/E355G/Y357F是影响酶作用pH和温度的关键位点。找到了一个酶嗜酸相关的重要的氨基酸位点E355，对E355位点进行了饱和突变研究，研究结果表明，该位点不仅与酶的作用pH相关，同时该位点与酶的催化效率密切相关，不同的突变使酶的比活和催化效率大幅度提高或降低。同时，我们发现甘露聚糖酶Bman5A作用的最适pH与酶的作用温度密切相关。同时，糖基化是影响酶嗜酸性的一个重要因素，糖基化位点N190，N91，N330，N365对甘露聚糖酶Bman5A的pH值影响大，单点突变及组合突变使其作用的pH由1.0变为2.0或2.5,即pH值向碱性移动了1.0或1.5个单位。综上，酶的嗜酸特性与酶靠近催化氨基酸的区域loop区、催化位点附近氨基酸E355，酶的作用温度及酶的糖基化密切相关。但我们在研究中也发现，点突变在不同的酶中对于决定酶的作用pH并不具有普适性。