极端嗜酸β-葡聚糖酶CelA4的嗜酸机制研究

首次从嗜酸热芽孢杆菌(Alicyclobacillus)中纯化、异源表达了一种极端酸性β-葡聚糖酶(CelA4)，是目前发现的最适pH(2.2-2.6)最低的β-葡聚糖酶，同时该酶对大麦葡聚糖，纤维素，木聚糖和甘露聚糖等均具有催化活性，在食品、饲料等工业领域中有较大应用潜力。酸性葡聚糖酶的嗜酸分子机理研究，不但有助于拓展对生物大分子结构与功能的了解, 也有望获得性能更为优良的酶。本研究在前期对原酶与重组酶性质研究的基础上，基于与其他不同pH特性的葡聚糖酶序列比对、同源建模和结构比对，并通过生物计算，分析酶蛋白的表面电荷、底物结合模型、pKa等重要信息，寻找与底物结合、催化以及酸适性相关的结构模块及关键性氨基酸位点，并对这些位点及空间邻近区域进行定点突变，验证相关氨基酸残基的作用，阐释其嗜酸机制，并为进一步的葡聚糖酶及其它糖苷水解酶的pH适性改造提供理论基础。

β-葡聚糖酶广泛应用于饲料，食品和能源中。饲料用酸性葡聚糖酶的应用效果已得到了公认。但是关于嗜酸葡聚糖酶底物特异性和嗜酸机制的研究目前还处在初步阶段。嗜酸热芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.A4)能够分泌高温酸性葡聚糖酶，本课题以糖基水解酶51家族极端酸性β-葡聚糖酶(CelA4) 为出发研究材料，并结合同家族的阿拉伯呋喃糖苷酶Ac-Abf51A，详细研究了51家族两种酶与底物结合和催化机制。1）通过序列比对和同源建模，发现了10个CelA4与底物结合和催化的关键氨基酸位点，并利用突变技术构建了对应的10个突变体，进一步对突变体进行了表达与酶学性质测定。结果证实E137，E253两个位点为催化位点，首次实验证明糖基水解酶51家族纤维素酶的催化位点，为该家族其他纤维素酶的研究提供了重要的实验数据。R59A、N105A、W37A、Y347A突变体酶活下降很多，N138A、Y212A、H210A、W293A未检测到任何酶活，因此上述氨基酸残基位点为与底物结合相关的关键位点。2）结合序列比对和突变实验结果，对其底物结合与酸碱催化相关的氨基酸区段进行了电荷方面的突变设计，期望获得与嗜酸相关的部分氨基酸位点，共计设计了3个突变体，并分别进行了表达与性质测定，3个突变酶的最适pH均与野生型相似，分析原因可能是同源建模的模型的可信度较差，因此后续开展CelA4的纯化与结晶工作。目前酶的纯化工作已经完成，正在利用实验室的自动结晶仪摸索结晶工艺。3）开展了同家族阿拉伯呋喃糖苷酶Ac-Abf51A研究工作，重组Ac-Abf51A同样具有宽泛的底物水解活性，其具有外切和内切阿拉伯呋喃糖酶活性的同时，还具有水解小麦木聚糖的能力，而且 Ac-Abf51A 能够将木六糖，木五糖和木四糖水解成更短的木二糖和木三糖。这是首次报导来源于GH51的具有内切木聚糖酶活性的a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。底物协同降解实验表明，Ac-Abf51A最有效的切割是阿拉伯木聚糖的主链，其次才是侧链，该部分内容已投稿到Biotechnology for Biofuels（On revised）。本课题初步开展了GH51家族葡聚糖酶CelA4的底物结合与催化机理及与嗜酸机制相关的研究工作，加深了对GH51糖基水解酶的认识，为该家族葡聚糖酶的分子改造提供了理论基础。