Peroxiredoxin 4在卵泡发育中的作用及机制研究

Antioxidant enzymes promote follicular development by preventing oxidative stress damage, inhibiting apoptosis. Peroxiredoxin 4 (Prx4), a member of antioxidant enzymes Prxs family, can inhibit active oxygen species activation as an anti-apopototic factor. It was screened out from our pilot experiment of mouse cumulus-oocyte complex (COC) protein profile; our pilot experiment also showed that the expression of Prx4 increased in granulosa cells as follicles growing, and reduced in granulosa cells of PCOS patients. There was no data to date about the functions of Prx4 on follicular development. We hypothesize that Prx4 protects the granulosa cells from oxidative stress damage and inhibits the apoptosis, contributing to follicular development. By using COC in vitro culture as a model, we will detecte oocyte and granulosa cells apoptosis related factors, as well as granulosa cells oxidative stress using RNAi, Prx4 overexpression as approaches. The morphology of the COC development will be observed also. We aim to explore the effects of Prx4 on follicular development and the potential mechanism in either physiological or pathological conditions. This study provide a theoretical basis for further study of the follicle development, developmental disorder-related diseases and assisted reproductive techniques of ovulation induction and immature oocytes in vitro maturing.

抗氧化酶通过阻止氧化应激损伤、抑制凋亡从而促进卵泡发育。Peroxiredoxin 4(Prx4)为抗氧化酶家族Prxs成员，抑制活性氧激活，为抗调亡因子。我们在小鼠卵母细胞-卵丘复合体（COC）蛋白质谱系中筛选得到Prx4，并证实Prx4随卵泡发育在颗粒细胞表达增加，在PCOS患者颗粒细胞中表达减少。Prx4调节卵泡发育的生理与病理作用未见研究。我们的假说：Prx4阻止颗粒细胞氧化应激损伤、调节其抗凋亡机制，从而促进卵泡发育成熟。本研究以体外培养COC为模型，采用RNAi、Prx4超表达等技术，通过COC发育的形态学观察卵泡发育、检测卵母细胞和颗粒细胞凋亡及其相关因子，以及颗粒细胞氧化应激水平，从生理、病理（PCOS）状态两个层面探讨Prx4在调节卵泡发育中的作用及机制。本课题为探索卵泡发育积累理论成果，增进卵泡发育障碍相关疾病的研究，也为ART促排卵及未成熟卵体外成熟技术提供理论基础。

本课题以COCs（卵母细胞-卵丘复合体）体外培养技术为基础，采用Prdx4超表达或表达沉默的技术，研究Prdx4在卵泡发育过程的作用及分子信号通路。也通过H2O2处理模拟PCOS卵巢的高氧化应激水平，从生理、病理（PCOS）状态两个层面验证了我们的假说：Prx4 阻止颗粒细胞氧化应激损伤、调节其抗凋亡机制，从而促进卵泡发育成熟。为探索卵泡发育积累理论成果，也为ART 促排卵及未成熟卵体外成熟技术提供理论基础。.第一部分：卵泡液中Peroxiredoxin4水平与卵母细胞受精率及优质胚胎率妊娠率成正相关。.第二部分：Peroxiredoxin4在调控卵泡发育中的作用 .1. 在人及小鼠卵巢组织中，其主要表达于卵泡颗粒细胞的细胞质中，随卵泡发育表达增加。 .2. PCOS患者及围绝经期妇女卵巢组织中Prdx4蛋白较育龄期妇女显著降低。在小鼠卵巢中其随小鼠年龄增加而升高，至成熟期达至高峰；至老年期降低。 .3.加入H2O2处理后，小鼠颗粒细胞增殖呈剂量依赖性的降低，凋亡发生剂量依赖性的增加； CDK1、CDK4、p21以及p15表达降低， caspase 3，caspase 9，caspase 12以及Bcl-2表达显著升高。.说明Prdx4与卵巢卵泡发育密切相关，通过抵御卵泡中氧化应激导致的细胞凋亡发挥调节作用。. 第三部分：Peroxiredoxin4促进卵泡发育的机制研究 .1. 小鼠COC体外培养过程中加入H2O2，卵丘扩展指数及卵母细胞成熟率呈剂量依赖性降低。 .2. 重组腺病毒Ad-Prdx4、Ad-Prdx4/SiRNA感染COC过程中，只能够感染外层卵丘细胞；H2O2处理COC过程中，加入重组腺病毒Ad-Prdx4或细胞内ROS清除剂Tiron，均可改善由ROS导致的卵丘扩展指数及卵母细胞成熟率下降。将卵母细胞与卵丘细胞机械分离及裸卵培养过程中无改变。.3. H2O2处理COC后，卵丘细胞内质网通路的重要因子CHOP10及GRP78的表达水平显著升高，GDF9和BMP15在卵母细胞中表达有显著升高来促进自身发育以及抗凋亡作用；当加入重组腺病毒Ad-Prdx4或加入Tiron处理，可显著抑制此改变。此外，卵丘细胞和卵母细胞中cAMP含量均显著升高；同时加入细胞内ROS清除剂Tiron或加入重组腺病毒Ad-Prdx4时，可显著降低cAMP水平。验证了假说。