人副流感病毒3型磷酸蛋白氨基端功能区域的研究

Human parainfluenza virus type 3 (HPIV3) is one of the significant cause of serious lower respiratory tract infection in infants and children. Currently, no valid antiviral therapy or vaccine is available. Based on previous bioinformatics analysis, our research is focused on the viral phosphoprotein. The characterization of conserved functional domain in N-terminal of P protein, the mechanism of the interaction between P and NP protein and the critical sites in P which is important for its interaction with NP, all of the above problems are remain to be clarified by using the methods of minigenome system, alanine-scanning mutation, and in vitro co-immunoprecipitaion .To characterize the detail function of the sites in P protein, the site mutant can be introduced into HPIV3 genome by the reverse genetics and try to get attenuated or temperature-sensitive HPIV3 which can be used for vaccine development. Besides, aimed at the functional domain in P protein, a short peptide can be designed and expressed, by examining the anti-virus effect of the short peptide at the level of minigenome and live virus, our ability to develop new antiviral therapy for the HPIV3 infection can be greatly enhance.

人副流感病毒3型（HPIV 3）是引起婴幼儿呼吸道疾病的主要病原之一，目前针对HPIV3还没有有效的抗病毒药物和疫苗。该项目在之前生物信息学预测的基础上，以磷酸蛋白为主要研究对象，通过使用微基因组检测、丙氨酸扫描突变、体外免疫共沉淀等方法，解析并寻找磷酸蛋白氨基端保守区域的功能及其与核衣壳蛋白发生作用的具体机制以及发生相互作用的关键氨基酸位点。通过将这些关键位点的突变引入到病毒的基因组中，构建带有突变的重组病毒，以期望在病毒水平研究这些关键位点的作用，并试图得到一些弱化的或对温度敏感的突变病毒株，用于疫苗研制。另外，在解析磷酸蛋白与核衣壳蛋白相互作用机制的基础上，将磷酸蛋白上与核衣壳蛋白相互作用有关的关键作用区域作为一个短肽进行表达，在微基因组水平、活病毒水平检测该短肽的抗病毒效果，以期望发现一种病毒感染后的短肽治疗方法。

人副流感病毒3型（Human Parainfluenza Virus type 3，HPIV3）是副粘病毒科呼吸道病毒属的一类重要的呼吸道病毒，是引起婴幼儿急性呼吸道疾病的主要病原之一，具有较高的感染率和致死率。目前，针对该病毒还没有有效的抗病毒药物和疫苗，因而研究HPIV3的复制机制将有助于抗病毒药物的研发。我们之前的研究表明HPIV3的磷酸化蛋白和核衣壳蛋白相互作用可以形成病毒转录、复制的中心---包涵体，但我们对包涵体的形成机制却不清楚。在该项目中，我们从病毒、细胞的角度出发，寻找参与包涵体形成的病毒蛋白和细胞宿主蛋白。通过活细胞实时观测，我们发现细胞内包涵体的形成是一个由小包涵体融合形成大包涵体的动态过程，病毒的转录和复制过程主要在大包涵体中完成。通过免疫共沉淀和质谱分析，我们发现细胞骨架蛋白---乙酰化微管通过与磷酸化蛋白和核衣壳蛋白形成的复合体相互作用，定位到细胞包涵体内并帮助病毒的复制。之后我们进一步发现病毒的基质蛋白对包涵体的形成也有非常重要的调节作用。通过使用与基质蛋白相互作用有缺陷的核衣壳蛋白突变体，我们证明基质蛋白通过与核衣壳蛋白发生相互作用，抑制包涵体的形成并影响病毒的RNA合成的能力，而且这种能力与基质蛋白形成类病毒颗粒的能力无关。同时，基于生物信息学预测的结果，我们进一步寻找了磷酸化蛋白上参与磷酸化蛋白与核衣壳蛋白相互作用的关键区域，并寻找到了一个关键的氨基酸位点。将这个氨基酸突变后，磷酸化蛋白与核衣壳蛋白相互作用就变得更加强烈，但这种强烈的相互作用反而影响了磷酸化蛋白与核衣壳蛋的可溶性以及功能的发挥。我们将这些关键的氨基酸位点引入到病毒基因组，构建了若干具有突变的重组病毒，这些重组病毒的性质正在进行进一步的检测，期望能够找到一些弱化的病毒，用于疫苗的研发。本课题的相关工作都已经发表在病毒学专业期刊上。我们希望通过我们的研究能够进一步解析人副流感病毒3型转录复制的具体机制，为抗病毒药物和疫苗的研发提供新的思路和实验依据。