人副流感病毒3型包涵体调节病毒RNA合成的分子机制

Many positive-stranded RNA viruses reorganized endo-membranes to form specialized replication organelles. However, it is largely unknown whether negative-stranded RNA viruses utilize intracellular membranes for their replication. Our previous studies showed that Human parainfluenza virus type 3 (HPIV3), a typical negative-strand RNA virus, replicates in inclusion bodies (IBs) (Virology, 2018; Viruses, accepted); Fusion of IBs is indispensable for replication of HPIV3; IBs can escape from antiviral activity of host cells by concealing viral RNA. Based on these results, we sought to explore whether IBs are the organelles derived from or utilize endo-membranes of host? In this study, we will identify and characterize the composition of IBs, and screen out the essential cell factors involving in viral replication via immunofluorescence, protein-protein interaction, mass-spectrographic, immune-electron microscopy and membrane composition extraction and purification. In summary, our study will further clarify how IBs accomplish the mission in HPIV3 replication.

很多正链RNA病毒重塑细胞内膜系统形成特殊的复制结构。然而负链RNA病毒是否也利用细胞内膜系统完成复制却知之甚少。申请人所在实验室以前的研究结果表明：人副流感病毒（HPIV3）的N-P相互作用调节病毒RNA的合成（Virology, 2018；Viruses, accepted）；包涵体融合形成成熟的包涵体是病毒RNA合成所必须的（Journal of Virology, 2017）；包涵体通过隐藏其合成的RNA逃逸宿主细胞的抗病毒反应（PLoS Pathogens, accepted）。在这些研究结果的基础上，我们期望揭示HPIV3的包涵体是否也利用细胞的内膜系统？包涵体发挥功能是否需要其他细胞因子的协助？本研究将通过免疫荧光、蛋白质与蛋白质相互作用、质谱分析、膜提取纯化和免疫电镜等技术，深入解析包涵体的组成、鉴定包涵体发挥功能所需的细胞因子，从而澄清包涵体调节病毒RNA合成的分子机制。

申请人所在实验室以前的研究结果表明：人副流感病毒（HPIV3）的N-P相互作用调节病毒RNA的合成；包涵体融合形成成熟的包涵体是病毒RNA合成所必须的；在此基础上，本研究将聚焦HPIV3的包涵体是否也利用细胞的内膜系统？包涵体发挥功能是否需要其他细胞因子的协助？本研究将通过免疫荧光、蛋白质与蛋白质相互作用、质谱分析、膜提取纯化和免疫电镜等技术，深入解析包涵体的组成、鉴定包涵体发挥功能所需的细胞因子，从而澄清包涵体调节病毒RNA合成的分子机制。通过本课题的完成，我们首先发现人副流感病毒使内质网碎片化，并利用内质网组分形成包涵体，碎片化的内质网围绕在包涵体周围保护其组分不被消化，保证病毒复制的有效进行。另外病毒P蛋白招募细胞因子PI4KB到包涵体上，形成富含PI4P的膜脂环境，有效促进病毒的复制，进一步澄清了包涵体发挥功能的分子机制。最后通过分析了其他负链RNA病毒包涵体与PI4K的关系，发现HRSV利用核衣壳蛋白（nucleoprotein，N）将PI4KB招募到包涵体中生成PI4P，其包涵体也利用了内质网成分。本研究为设计直接靶向负链RNA病毒复制平台的新型抗病毒药物奠定理论基础，具有重要的现实意义（Cell Reports, 2019）；随后，我们利用免疫共沉淀技术，筛选到大量与N-P复合物相互作用的宿主蛋白，并从中鉴别到宿主蛋白VIM，发现该蛋白可以抑制病毒复制以及病毒包涵体的形成。进一步，我们发现VIM蛋白通过促进微管乙酰转移酶α-TAT1的降解，导致微管乙酰化水平降低，从而抑制HPIV3复制的抗病毒机制。这项研究首次揭示了VIM蛋白抑制HPIV3复制的分子机制，并鉴定到一段来源于VIM蛋白的抗病毒多肽，为抗HPIV3药物研发提供了新的思路（PLoS Pathogens, 2022）。