MIF基因沉默/过表达与AS斑块易损性关系研究

P53基因局部转染已置入硅胶环的12周龄雄性ApoE-/-小鼠颈动脉以建立AS易损斑块模型；以巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）为靶点，采用RNAi技术构建rLV-U6/siMIF慢病毒载体；采用Adeasy-1系统构建pAd-eGFP-MIF腺病毒载体。将rLV-U6/siMIF慢病毒和Ad-eGFP-MIF腺病毒分别转染LPS预刺激的小鼠血管平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞；定位转染ApoE-/-小鼠颈动脉易损斑块局部，分别设立rLV/LacZ、Ad/lacZ和PBS为对照。应用病理组织学、实时三维超声、OCT、IUVS、mCT和分子生物学等技术对易损斑块的影像学特征和分子机制进行系统研究；检测MIF shRNA和MIF基因转染后血清MIF浓度变化；比较苯肾上腺素触发易损斑块破裂的发生率。探讨选择性阻断/上调MIF基因与AS斑块易损性的关系，明确MIF基因在稳定易损AS斑块中的作用和地位。

本项目申请较早，在项目批准和实施过程中已有许多研究证实巨噬细胞迁移抑制因子MIF基因促进了apoE-/-小鼠动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）病变进程，而且MIF基因在AS斑块易损中的作用也基本定论。虽然研究表明MIF具有促进炎症细胞活化和多种炎症因子表达的作用，局部聚集的白细胞及其表达的各种促炎细胞因子进一步促进了动脉粥样硬化病变过程。但MIF基因在糖尿病AS病变进程中的作用有待研究。近年来广泛采用STZ诱导的糖尿病ApoE-/-小鼠动物模型。美国糖尿病并发症动物模型协会（Animal Models of Diabetic Complications Consortium，AMDCC）和大量实验研究也证实了该模型的可行性。既往研究者多采用高脂饮食喂养此模型，极少采用正常饮食。主要因为高脂喂养可使小鼠高胆固醇（TC）水平剧烈增加。事实上，临床合并动脉粥样硬化的糖尿病患者血脂TC水平增加并不明显。而且高血糖和高胆固醇双重复杂因素的刺激不利于糖尿病AS疾病机制和干预的研究。且高脂饮食联合链脲菌素（Streptozotocin，STZ）诱导糖尿病ApoE-/-小鼠模型不能反映临床合并动脉粥样硬化的糖尿病患者真实状态。基于上述原因，并且为避免重复研究，本课题在模型上稍做调整，采用腹腔注射链脲菌素（Streptozotocin，STZ）建立糖尿病ApoE-/-小鼠模型，探讨MIF基因沉默/过表达对糖尿病apoE-/-小鼠AS病程和易损斑块的作用及其机制，结果发现：采用小剂量STZ持续腹腔注射apoE-/-小鼠模型呈现出高血糖、糖耐量受损和高血脂。正常饮食饲养下，糖尿病组ＡＳ斑块面积较非糖尿病对照组明显增加，其中脂质、巨噬细胞、Ⅰ和Ⅲ型胶原、血管壁平滑肌细胞含量增加。因此本研究可能是对传统糖尿病动脉粥样硬化动物模型的简化和改进，未来有利于进行糖尿病合并动脉粥样硬化疾病的机制和干预研究。MIF基因干扰可明显下调STZ诱导的糖尿病ApoE-/-小鼠血管巨噬细胞以及炎症因子表达（IL-6、 TNFα、 MIF、 ICAM和VCAM），减少脂质沉积，增加胶原和平滑肌细胞含量，改善糖和脂质代谢，从而抑制动脉粥样硬化斑块的进展，同时发现MIF基因干扰减少ApoE-/-小鼠血管MMP-2/TIMP-1比值和斑块易损指数，进而增加AS斑块稳定性。