酸敏感离子通道ASIC1a介导脑缺血神经损伤的机制及其N-端小分子神经保护肽的研究

Acidotoxicity is one of the leading causes of neuron death after ischemic stroke. Recently, we have demonstrated that extracellular protons trigger neuronal necroptosis via acid-sensing ion channel 1a (ASIC1a), but independent of its ion-conducting function. Acid stimulation recruits receptor-interacting protein 1 (RIP1) to the ASIC1a C-terminus, causing RIP1 phosphorylation and subsequent neuronal necroptosis. Our unpublished data further showed that ASIC1a N-terminus has neuroprotective effects via interaction with its C-terminus, which may indicate novel mechanisms underlying necroptosis. In this project, we aim at confirming the non-ion channel function of ASIC1a in neuronal necroptosis after ischemic stroke by using ASIC1a mutant mice, investigating the signaling pathways, screening and identifying the neuroprotective peptides targeting ASIC1a. The project will enrich and extend the role of ASIC1a in ischemic neuronal cell death, develop new neuroprotective peptides and promote the translational research of ASIC1a channels, which may result in therapeutic drugs for stroke therapy.

缺血区组织酸化是中风后神经元死亡的主要原因之一。申请人所在课题组近期报道酸敏感离子通道1a（ASIC1a）通过其胞内C-端构象变化偶联受体结合蛋白1（RIP1）磷酸化介导缺血后神经元程序性坏死。预实验结果显示ASIC1a N-端部分序列具有神经保护作用，且与抑制C-端特定序列CP-1有关。在本项目中，我们将通过CRISPR-Cas9技术构建ASIC1a离子通道功能缺失的HIF-ASIC1a小鼠和保留通道功能而C端功能缺失的RC-ASIC1a小鼠，阐明ASIC1a非通道功能参与中风后神经元程序性坏死及其信号通路，揭示ASIC1a N-端神经保护的具体机制，以N-端氨基酸序列设计筛选小分子神经保护肽，并在动物中风模型中验证。该项目将深化和扩展ASIC1a在缺血性神经元死亡中的作用机理，并以ASIC1a为靶点探索新型小分子神经保护肽，推动基础研究向临床转化方向发展，促进中风治疗新药的开发。

酸敏感离子通道1a (acid-sensing ion channels, ASIC1a)是中枢神经系统分布广泛的酸化（H+）感受器，是酸毒性神经死亡的主要介质和脑缺血后神经保护的潜在干预靶标。长期以来，ASIC1a作为离子通道介导的细胞内Ca2+超载被认为是其缺血性脑损伤的重要机制。2015年，申请人所在课题组发现质子除了激活ASIC1a通道的“离子门控”途径外，还能引起通道蛋白的整体变构，导致其C末端与受体结合蛋白1（receptor-interacting protein 1, RIP1）结合，启动细胞程序性坏死，但具体机制并不清楚。本项目在课题组前期研究的基础上，旨在阐明ASIC1a的非通道功能(变构信号)介导缺血性神经元死亡的信号通路。主要研究内容包括以下3个方面：（1）通过Rosetta计算机建模、荧光能量共振转移（FRET）以及药理学和基因学等干预手段，在细胞模型中证实ASIC1a通道胞内N末端对其C末端存在动态相互作用，胞外H+激活ASIC1a诱导变构效应，导致C末端与N末端解离。（2）在组织酸化条件下，N-乙基-顺丁烯二酰亚胺敏感性融合ATP酶（N-ethylmaleimide-sensitive fusion ATPase, NSF）通过结合并稳定通道胞内N末端导致后者与C末端解离，实现C末端与RIP1的结合并启动细胞程序性坏死。（3）根据ASIC1a胞内N-端和C-端相互作用的氨基酸序列，设计小分子多肽，在细胞和动物模型筛选靶向ASIC1a的神经保护肽。该研究不仅完整阐明了ASIC1a通道代谢信号机制的结构基础，还基于通道胞内N端氨基酸序列筛选出在细胞和动物脑卒中模型有良好神经保护作用的小分子肽,推动脑疾病基础研究向临床转化方向发展,促进了脑卒中治疗新药的开发。