Smad7与β-catenin在糖尿病溃疡创面上皮化进程中的作用及祛瘀生肌中药干预研究

The proposal is based on on the clinical effects of the Tradidional Chiese Medicin methods of "qu-yu-sheng-ji,QYSJ" (removing stasis tissues to stimulate the growth of new skin) on diabetic ulcer, and our published data including 1) QYSJ herbs can increase keratinocyte's migration and proliferation by down-regulating beta-catenin expression (Published in eCAM);2) Smad7 transgenic ketatinocyates have the ability to improve migration and proliferation by countering TGFbeta signaling pathway (Published in AJP and Nature Medicine). This proposal is designed to verify our hypothesis that TCM QYSJ method could regulate beta-catenine through Smad7 to promote wound re-epithelialization.To explore this, we will use two different diabetic mice model(streptozotocin-induced and db/db model, respectively),combined with ChIP, IP, plasmid transfection，luciferase assay, keratinocytes-special adenovirus infection, hybridization in situ and immunofluorescence methods to explore the function of QYSJ herbs in the crosstalk of Smad7 and beta-catenin, and demonstrate the influence of those down-stream target gene in the process of diabetic wound reepithelialization. This study will further enrich our view of"removal of stasis is beneficial for the growth of new tissues with little scar".)

基于"祛瘀生肌法"的临床疗效，以及课题组前期研究证实：1）祛瘀生肌中药具有降低β-catenin表达,纠正Wnt信号通路过度激活导致的角质形成细胞增殖与迁移抑制作用(eCAM)；2）角质形成细胞高表达Smad7具有明显拮抗TGFβ信号通路，从而促进细胞增殖与迁移（AJP and Nature Medicine）。本申请围绕"祛瘀生肌法"是否通过Smad7降低β-catenin表达促进创面上皮化这一科学假说，采用两种不同病理模式的糖尿病溃疡模型（链脲佐菌素和db/db），综合ChIP、IP、质粒转染、Luciferase assay、逆转录病毒感染、原位杂交和免疫荧光等方法，通过深入研究祛瘀生肌中药在Smad7和β-catenin及其下游靶基因在角质形成细胞上皮化中作用和调控机制，从而为"祛瘀利于生肌，生肌不致成瘢"的学术观点进一步丰富其科学内涵。

项目研究背景：祛瘀生肌法是中医外科临床常用基本大法。早期课题组从成纤维细胞，I、III型胶原沉积与代谢角度阐释了部分机制，但对于角质形成细胞的上皮化形成过程仍不清楚。上皮化进程是创伤愈合最重要的中间环节。明确这一关键环节，对于丰富名老中医学术观点具有显著理论价值和临床推广意义。.主要研究内容：本项目基于“祛瘀生肌法”的临床疗效，以及前期基因芯片筛选数据，将生肌化瘀方采用不同极性试剂进行萃取，筛选出最有效的极性组分，围绕“祛瘀生肌法”是否通过Smad7，beta-catenin，c-myc等基因发挥促进创面愈合的作用展开。动物实验采用两种不同病理模式的糖尿病溃疡模型（链脲佐菌素和db/db），综合ChIP，逆转录病毒感染、免疫组化技术等方法，通过深入研究不同极性提取部位的祛瘀生肌中药组分，愈创疗效差异，观察最有效组分对Smad7和beta-catenin及其下游靶基因c-myc在角质形成细胞上皮化中的影响，进一步丰富“祛瘀生肌法”的学术观点；.重要结果：课题组成功构建了特异性的靶向性质粒，体内外研究均表明可以显著激活角质形成细胞中beta-catenin和Smad7信号通路的表达，其中干预组是对照组的10倍以上。Smad7染色质免疫共沉淀检测显示祛瘀生肌中药通增强与Smad7相关基因启动子的结合，刺激Rac2，Rnd等迁移相关分子，诱导Cmyc表达增强，改善炎症反应，促进创面愈合。而且生肌化瘀方对于不同病理背景下的糖尿病溃疡均有效，显示生肌化瘀方可有效治疗糖尿病溃疡，且有效活性部位为氯仿提取部位；进一步建立了所提取的混合物活性部位主要化学成分（菲醌类、黄酮类、香豆素类、蒽醌类）的检测方法，为准确有效地评价活性物质群质量提供了科学依据。.科学意义：本项目是在中医传统理论“祛腐生肌”理论基础上，针对临床难愈性溃疡“热”、“瘀”、“虚”的临床特点，提出“祛瘀利于生肌，生肌不致成瘢”学术观点。对角质形成细胞上皮进程中的作用及祛瘀生肌中药的调控机制，可为后续祛瘀生肌特色疗法的临床推广和新药开发提供新参考。