QDPR/BH4途径在糖尿病肾病内皮功能障碍中的作用及柴黄益肾颗粒的干预机制研究

Endothelial dysfunction（EDF） plays an important role in the pathogenesis of diabetic nephropathy（DN）. As an essential cofactor required for eNOS activity, BH4 with a decreased level is a major factor of EDF by leading to eNOS uncoupling and consequent loss of NO bioavailability. Our previous studies has firstly revealed the abnormality of QDPR in DN, which is critical in regulating BH4 level. Changhuang-Yishen Granule(CHYS) could reverse the downregulation of renal QDPR expression in DN.However, the role of QDPR in DN remains to be clarified. In this study, we plan to observe the changes of QDPR/BH4 pathway and eNOS/NO and ETF marker under the condition of DN.Then we will analyse the relationship of these changes and renal injury with both in vitro and in vivo experiments. Furthermore,we plan to clarify the role of QDPR/BH4 mediated EDF in DN pathogenesis by utilizing plasmid transfection and siRNA technology and then investigate the intervention of CHYS on the pathway. Finally,we plan to identify the target zone of CHYS on the regulation of QDPR promoter by luciferase reporter genes system. The research will exhibit important significance in exploring the new target of drugs in DN, and revealing the molecular mechanism and biological connotation of CHYS in treating DN.

内皮功能障碍（EDF）在糖尿病肾病（DN）发病中具有重要作用，四氢生物喋呤（BH4）作为eNOS的必需辅因子，其含量降低导致的eNOS脱偶联和NO生物利用度降低，是引起EDF的关键因素。前期研究发现：调节BH4含量的关键酶QDPR在DN中发生了明显改变，但其在DN中的作用尚未见报道。已获得临床批件的柴黄益肾颗粒能逆转DN大鼠QDPR的下调。基于此发现，本研究拟利用定量PCR、Western blot及流式细胞等技术，结合动物及细胞实验，通过重组质粒及siRNA转染方法，分析QDPR/BH4途径、eNOS脱偶联及EDF改标志分子改变与DN病变的关系，揭示QDPR/BH4途径在DN中EDF的作用及柴黄益肾颗粒的调控机制，并利用萤光素酶报告基因系统明确柴黄益肾颗粒调节QDPR启动子的特定区域。本研究对于DN药物新靶标的发现及柴黄益肾颗粒治疗DN分子机制及生物学内涵的阐释，具有重要意义。

内皮功能障碍与糖尿病肾病（DN）发生发展密切相关，QDPR作为调控eNOS必需辅因子BH4 含量的关键酶，其含量减少导致NO 生物利用度降低，是引起内皮功能障碍的关键因素。前期研究证实QDPR在DN模型中表达降低，但其在DN 中的作用尚未见报道。柴黄益肾颗粒治疗DN疗效确切，能够上调QDPR表达。基于此发现，本研究拟利用定量PCR、Western blot 及慢病毒转染等技术，通过体内外实验分析QDPR/BH4 途径、eNOS /NO及内皮功能障碍标志分子改变与DN 病变的关系，揭示QDPR/BH4 途径在DN 中内皮功能障碍中的作用及柴黄益肾颗粒的调控机制。结果发现QDPR表达在糖尿病肾病患者肾活检标本显著降低，提示其在DN进展中可能发挥重要作用。体外研究证实QDPR过表达逆转了高糖引起的人微血管内皮细胞HMEC-1细胞数量减少，其机制与改善Nrf2介导的抗氧化通路、抑制凋亡分子Capase3及cleaved caspase 3有关；体内外研究发现，柴黄益肾颗粒上调DN模型QDPR表达，增加BH4水平，升高eNOS及p-eNOS水平，促进Nrf2及其下游分子GPX3表达，降低Capase3及cleaved caspase 3表达，抑制细胞凋亡，改善内皮功能障碍及肾损伤。在此基础上进一步利用双荧光素酶报告基因技术发现了QDPR启动子的核心调控区域，揭示了柴黄益肾颗粒作用QDPR启动子的靶区域。揭示了QDPR/BH4途径在糖尿病肾病中的作用及柴黄益肾颗粒调控机制，推动了DN 药物新靶标的发现及柴黄益肾颗粒治疗DN生物学内涵的阐释。