动物梨形虫条形码基因的挖掘与DNA分类工具的建立

本实验室2006年-2008年所承担的国家自然科学基金项目（30571397）曾对依托于我单位的中国兽医微生物菌种保藏中心原虫分中心内收藏的20多种30余株兽医原虫的18SrRNA和ITS1-5.8S-ITS2基因区段的序列进行了分析比较，并对它们充当分子标志的特点进行了讨论，以这些分子为靶标建立了PCR、LAMP、RLB等分子检测方法，试验证实它们均具有一定应用价值。本研究旨在已有工作的基础上，结合国际生物条形码计划的最新研究成果，继续对线粒体COⅠ和Cyt b、28S rRNA、裂殖子表面蛋白（MSP）等基因进行测序，利用生物信息学手段对每个基因隐含的条形码信息进行分析，在国际上首先提出适合作为动物梨形虫DNA条形码的最佳基因；以条形码基因为靶标，分别设计一系列针对科、属、种等分类阶元特异的核酸探针，建立可用于动物梨形虫分类的虚拟DNA芯片和DNA芯片，为病原分类和疾病诊断提供工具。

测定了我国牛羊梨形虫主要地方分离株的COⅠ和Cyt b、28S rRNA等区段的序列，并对它们及18SrRNA、ITS1-5.8S-ITS2等序列进行了分析。主要内容包括：.1、28S rRNA基因序列，对分离自中国的11株巴贝斯虫进行系统进化分析。结果表明：巴贝斯虫28S rRNA序列长度在 2,878 bp-3,017 bp之间，28S + 18S片段的长度为4,531bp-4,732bp，28S比18S含有较多的序列信息，能够较好的阐明莫氏巴贝斯虫（Babesia motasi），大巴贝斯虫（Babesia major）和牛巴贝斯虫（Babesia bovis）的系统发生关系，可作为用于巴贝斯虫的系统进化关系。.2、对国内牛和绵羊的13株泰勒虫的大亚基核糖体RNA序列（28S rRNA）进行扩增与测序。结果显示：泰勒虫28S rRNA序列长度在 3,031bp-3,061bp之间，可作为泰勒虫分子分类及系统进化分析的一种新的分子标记基因；28S rRNA基因的D2–D3区的短片段（约为 497 bp），区分各种泰勒虫的能力与其全长相当。.3、对包括18S rRNA、28S rRNA、ITS、COI的全长，以及它们的部分序列（18SD、28SD、ITS1、ITS2）在内的8段DNA区域的484条序列，按照国际条形码联盟推荐的方法进行了DNA条形码可行性分析。结果发现：ITS2具有100%的扩增效率，理想的序列长度，种间差异与种内差异之间的gap明显，在属一级水平上的正确鉴定率为98%，在种一级水平上的正确鉴定率为92%。在目前数据基础上，ITS2是梨形虫进行分类鉴定的最适条形码基因。.4、采用系统进化分析以及计算分子钟的方法，探讨了基于COI基因的硬蜱-梨形虫之间的协同进化关系。结果显示：梨形虫的分化时间约为56Mya，晚于其媒介硬蜱的分化时间（约为86Mya），这说明梨形虫的生物多样性并非由其宿主的分化所致。.5、建立了PCR-RFLP、LAMP、RLB等可用于梨形虫DNA分类及诊断的方法，具有较高的特异性和敏感性。