糖基化纤维连接蛋白对血管内皮生长因子介导的血管新生的影响及其机制研究

Vascular endothelial growth factor (VEGF) resistance has been demonstrated as a molecular basis for the impaired angiogenesis in diabetes mellitus. The molecular mechanism underlying VEGF resistance is not fully understood. Fibronectin (FN) and its receptor α5β1 integrin significantly enhance VEGF signaling and VEGF-induced angiogenesis. However, no previous studies have implicated the glycation of FN in VEGF-induced angiogenesis. Our preliminary results demonstrate that glycated FN showed a change in protein structure, which linked to reduce VEGF-induced endothelial cells adhesion and migration. The results indicate glycated FN may change angiogenic function of VEGF. Furthermore, glycated FN activated p38 and extracellular regulated protein kinas (ERK) via receptor for advanced glycation end products (RAGE) but not α5β1. These results suggest that the receptor of glycated FN may change from α5β1 integrin to RAGE. Based on these findings, we hypothesize the following aims: (1) Explore the effects of glycated FN on VEGF signaling and VEGF-induced angiogenesis; (2) Clarify the mechanism of glycated FN down-regulating VEGF signaling via α5β1 and/or RAGE signaling pathway. We anticipate that the proposed studies will provide a novel therapeutic target for treatment of impaired angiogenesis in people with diabetes mellitus.

VEGF抵抗是糖尿病血管新生障碍的重要原因，但其机制远未阐明。纤维连接蛋白（FN）及其受体α5β1共同参与调节VEGF介导的血管新生。糖尿病导致FN糖基化，而糖基化FN对VEGF功能的影响目前仍不清楚。我们前期研究发现：糖基化FN显著降低VEGF介导的内皮细胞粘附和迁移，提示糖基化FN可能影响VEGF的促血管新生功能；糖基化FN还通过晚期糖基化终产物受体（RAGE）激活p38和ERK，提示糖基化后FN受体可能从α5β1变为RAGE，并可能因此影响VEGF信号。本项目拟在上述研究基础上从分子、细胞和整体水平利用免疫共沉淀、RNA干扰、下肢缺血模型等手段进一步查明：（1）糖基化FN对VEGF信号和VEGF介导血管新生的影响；（2）糖基化FN通过α5β1和/或RAGE通路调控VEGF信号的分子机理。旨在阐明VEGF抵抗的机制，为防治糖尿病血管新生障碍提供新的理论依据和治疗靶点。

项目背景：糖尿病时血管内皮生长因子（VEGF）信号激活障碍是糖尿病血管新生不足的重要原因，其机制仍未阐明，纤维连接蛋白（Fibronectin，FN）糖基化可能在其中发挥重要作用。本研究旨在探讨糖基化FN（AGE-FN）对VEGF信号及其介导血管新生的影响及机制。 研究内容：以体外培养的内皮细胞和整体动物为研究对象，探讨AGE-FN对VEGF信号激活及其介导血管新生的影响；并从VEGF受体-2（VEGFR-2）和c-Src相互作用的角度，阐明AGE-FN调控VEGF信号的分子机制。 重要结果：本研究首先体外制备AGE-FN并对其进行鉴定，发现糖基化后FN之间发生交联反应，AGE-FN分子量增大，AGEs形成显著增多；利用体外制备的AGE-FN，在细胞水平证实AGE-FN抑制VEGF介导的内皮细胞迁移和管腔形成，并抑制VEGF介导的VEGFR-2、Akt、ERK1/2激活以及VEGFR-2-c-Src复合物形成；AGE-FN直接与RAGE结合，介导RAGE-c-Src复合物的形成，并因此剥夺VEGFR-2对c-Src的招募，抑制VEGFR-2和c-Src的相互作用，而RAGE特异性抗体解除了AGE-FN对VEGF信号的抑制。在动物水平，利用糖尿病小鼠下肢缺血模型发现，糖尿病导致小鼠下肢腓肠肌FN糖基化显著增多；缺血诱导正常小鼠和糖尿病小鼠VEGF表达都显著增多，但糖尿病小鼠缺血侧血管新生显著降低，这提示，在动物水平AGE-FN抑制VEGF信号及其介导的血管新生。 关键数据：获得了AGE-FN抑制VEGF介导内皮细胞迁移和管腔形成的数据；获得了AGE-FN抑制VEGF信号激活的数据；获得了AGE-FN抑制VEGFR-2和c-Src相互作用的数据；获得了AGE-FN与RAGE直接结合并介导RAGE-c-Src复合物形成的数据。 研究结论：糖尿病时AGE-FN形成显著增多，AGE-FN通过与RAGE直接结合并介导RAGE-c-Src复合物形成剥夺了VEGFR-2对c-Src的招募，解偶联VEGFR-2和c-Src的相互作用，抑制VEGF信号的激活及VEGF介导的血管新生。 科学意义：本项目研究结果提示FN糖基化可能是导致糖尿病时VEGF信号激活障碍重要原因，这为揭示糖尿病血管新生障碍的机制提供了新的着眼点和突破口，为临床上预防和治疗糖尿病缺血性病变提供理论依据