新的金黄色葡萄球菌肠毒素SEE2的特性及其介导ST6型菌株食物中毒机制研究

Staphylococcus aureus (S. aureus) is an important foodborne pathogen. Our preliminary experiments have shown that a novel enterotoxin SEE2 is commonly associated with many foodborne outbreaks caused by S. aureus ST6. The aim of this proposal is to elucidate the characteristics and toxicity mechanism of SEE2. SEE2 will be obtained from an expressing vector containing see2 gene. The characteristics and biological activity of SEE2 will be determined by Western blot, lymphocyte proliferation test, digesting enzyme tolerance test, heat stability test, mouse lethality test and kitten emesis test. After constructing sea and see2 single gene and double genes knockout in S. aureus ST6 strains, the toxicity of culture supernatant of each mutant strain was compared with control strain by testing the mortality of mice and the frequency and severity of emesis in kitten. These findings will clarify the role of SEE2 in the pathogenesis of S. aureus ST6 and mechanism of action of SEE2 in staphylococcal food poisoning, which will provide theoretic basis for prevention and control of illness caused by S. aureus.

金黄色葡萄球菌(金葡菌)是一种重要的食源性致病菌。本课题组前期研究表明众多金葡菌引起的食物中毒事件与ST6型金葡菌表达一种新的肠毒素SEE2密切相关。为阐明肠毒素SEE2的特性及其毒性机制，本课题以原核表达SEE2蛋白为材料，采用Western blot方法、体外淋巴细胞增殖试验、体外耐消化酶及耐热性试验、小鼠致死试验和和幼猫呕吐试验，确证SEE2蛋白的肠毒素特征及生物活性；通过构建sea和see2单基因或双基因敲除ST6型菌株，对比分析sea和see2基因敲除前后细菌培养上清液对小鼠致死率及幼猫催吐能力的差异，阐明see2基因对ST6型金葡菌致病性的影响。本研究将揭示新的肠毒素SEE2在ST6型金葡菌引发食物中毒方面的作用机制，为金葡菌引起的食物中毒的防控提供理论依据。

金黄色葡萄球菌(金葡菌)是一种重要的食源性致病菌，前期发现金葡菌引起的食物中毒事件与ST6型金葡菌除肠毒素A以外表达一种与肠毒素E存在抗原交叉的新型肠毒素密切相关，其机制尚不明确。本项目通过金葡菌597株的2代测序和2株（ST6型124菌株和ST7型265菌株）的3代测序，其中包括食物中毒源菌株165株和食品源菌株432株，通过全基因序列分析和PCR全基因扩增确证了携带肠毒素A的ST6型和ST7型菌株主要同时携带2种新型肠毒素SELW和SELX基因。通过克隆和表达SEA、SELW和SELX蛋白，最终表达和纯化出SEA和SELX蛋白，而SELW蛋白未表达出；通过100℃恒温加热，37℃模拟体外胃蛋白酶及胰蛋白酶消化水解处理 SEA和SElX重组蛋白纯化样品，以SDS-PAGE验证SEA和SELX的耐热及酶水解性，以CCK-8法验证SEA和 SELX的超抗原活性，发现SEA和SELX均具有耐热性及耐胃蛋白酶水解性，但SEA对胰蛋白酶的耐受性较和SELX强，此外，也发现SEA和SELX也具有超抗原活性。SEA和SELX对小鼠致死率及幼猫腹泻和呕吐能力的差异分析，发现基因缺失株相对于原始菌株延缓了小鼠的致死率，但肠毒素A的呕吐频率较SELX强，揭示了SEA和SELX蛋白具有葡萄球菌肠毒素特征。通过构建sea和selx单基因敲除ST6型或ST7型菌株，对比分析sea和selx单基因敲除菌株与原始菌株细菌培养上清液对小鼠致死率及幼猫腹泻和呕吐能力的差异分析，结果发现sea和selx单基因缺失株均降低了幼猫食物中毒呕吐效应，均延缓了小鼠的致死率，提示了SEA和SELX在ST6型和ST7型金葡菌菌株系引发的食物中毒和致病性中发挥重要作用。以上的研究结果为金葡菌引起的食物中毒的防控提供理论依据。