A型流感病毒NS1蛋白通过结合宿主LRPPRC蛋白影响病毒复制机制的研究

The influenza A virus (H1N1) in 2009 had caused worldwide infections spreading and even leading to death. This had seriously harmed public health security. Previous studies have confirmed that this strain has obvious characteristics of high level of replication, but its molecular mechanism has not been elucidated yet. Earlier research data found that the NS1 protein can significantly improve the H1N1 virus replication by binding with LRPPRC protein, which can significant inhibit the mitochondrial autophagy. Overexpress LRPPRC protein can significantly improve the H1N1 rescued virus production. Thus, we predict that the H1N1 influenza virus may regulate mitochondrial autophagy by NS1 - LRPPRC interaction, to achieve its high levels of replication in cell. To prove the hypothesis, on one hand, we will build LRPPRC gene knock out and over expression cell line, evaluate the effect of LRPPRC protein on virus replication; on the other hand, we will try to detect the Mitochondrial membrane potential changes caused by NS1 protein and LRPPRC interaction and determine the amino acid binding sites, clarify the regulating mechanism of mitochondria autophagy by NS1 protein and LRPPRC interaction. Through the project, we aim to improve the understanding of the characteristics of interaction between influenza virus and the host, create new strategy of preventing influenza virus infection.

2009年甲型H1N1流感病毒席卷全球，引发大范围感染甚至死亡，严重危害公共卫生安全。已有研究证实，该毒株具有明显的细胞内高水平复制特征，但其形成机制尚未阐明。我们的前期研究数据发现，H1N1 NS1蛋白可显著提高马流感病毒粒子产生水平，且该蛋白可特异性结合具有显著抑制线粒体自噬功能的宿主蛋白LRPPRC，而过表达LRPPRC蛋白又可明显提高拯救病毒的产量。由此，我们推测H1N1流感病毒可能借由NS1-LRPPRC-线粒体自噬途径，实现其在细胞内的高水平复制。为证实该假设，我们将构建LRPPRC基因缺失与过表达细胞系，检测NS1蛋白结合LRPPRC后线粒体膜电位的变化，并确定氨基酸结合位点，阐明NS1蛋白通过LRPPRC调节线粒体自噬的机制。通过本项目的开展，将增进对流感病毒与宿主互作，尤其是病毒通过调控细胞线粒体自噬进而影响自身复制机制的理解，有助于发现防治流感病毒的新策略。

A型流感病毒宿主广泛，可分为多个亚型但传播能力有所不同。我们在比较2009年造成大流行的A型流感病毒SC09毒株以及在1989年仅引起局部流行的马流感病毒JL89毒株时，发现IAVSC09在病毒拯救时的出毒量远大于IAVJL89，随后本研究利用在这2株流感病毒的反向遗传操作系统进行片段互换，发现IAVSC09 NS1蛋白是显著提高其复制水平的关键蛋白。进一步研究发现IAVSC09 NS1能够诱导更为显著的细胞自噬。为探究IAVSC09 NS1促进细胞自噬的机制，利用flag-pull down联合质谱分析发现宿主蛋白LRPPRC具有较高评分，随后利用IP实验及免疫荧光实验均进一步证明IAVSC09 NS1与LRPPRC之间存在相互作用。有研究表明LRPPRC 在保持线粒体膜电位稳定方面有一定作用，也可通过与 Bcl-2、Beclin1、MAP1S 等互作参与自噬调节。本研究发现在293T细胞内稳定表达LRPPRC蛋白能够抑制IAV感染诱导的宿主细胞自噬水平，进而抑制病毒复制。而稳定敲低LRPPRC表达能够提高IAV感染诱导的宿主细胞自噬水平，促进病毒复制。表明宿主蛋白LRPPRC能够通过抑制IAV诱导的宿主细胞自噬进而抑制流感病毒复制。进一步研究发现IAVSC09 NS1与LRPPRC结合后能够通过诱导高水平自噬而促进病毒复制。我们构建了带有SC09 NS1和JL87 NS1的WSN重组病毒进行感染实验，结果表明重组病毒WSN_SC09 NS1在野生型293T细胞中诱导自噬的能力以及复制水平均高于重组病毒WSN_JL89 NS1，而在敲低LRPPRC的293T细胞中两种病毒的复制水平以及诱导细胞自噬的能力无明显差异。表明IAVSC09 NS1能够拮抗LRPPRC对病毒复制的抑制作用。进一步研究发现，IAVSC09 NS1能够通过与LRPPRC蛋白的相互作用进而将Beclin1蛋白在LRPPRC，Beclin1，Bcl-2复合物中释放出来，促进Beclin1与下游信号分子PI3KC3结合，从而启动自噬。本研究系统阐释了AIV NS1通过结合LRPPRC而调控细胞自噬的分子机制，为流感病毒的预防和控制提供了理论基础。