宿主蛋白CLK1及其抑制剂调控甲型流感病毒复制的机制

Since the genes of Influenza A viruses are easy to mutate, it can easily produce drug resistance against the drugs targeting viral proteins, and therefore influenza A viruses seriously threaten human life and health. Selecting the host protein which is temporarily dispensable for the host but crucial for virus replication is an important way to solve the problem of drug resistance. Human CDC like kinase 1 (CLK1) as a key protein of influenza virus replication process is expected to become a new target for anti influenza drugs. The program will base on the CLK1 inhibitors screening and discovery and their anti-influenza activity evaluation, and carry out the following research: Through the establishment of CLK1 gene knockout cell model and the existing CLK1 over expression mode, the influence of CLK1 on the phosphorylation level of viral transcription splicing factor SR, and the regulation of the phosphorylated SR on pre-mRNA expression of alternative splicing and viral proteins will be studied; Using cell immunofluorescence method, the effects of CLK1 inhibitors on the phosphorylation of SR, and therefore regulating pre-mRNA alternative splicing and viral protein will be investigated; The efficacy of CLK1 inhibitors against virus resistant strains will be confirmed. Finally, the mechanism of CLK1 and its inhibitors regulating influenza A virus replication will be elucidated, the advantages of CLK1 will be confirmed. This program will lay important theoretical foundation for anti-influenza drug targeting CLK1.

甲型流感病毒的基因易于变异，对于靶向病毒蛋白的药物易于产生耐药性，严重威胁人类的生命健康。选择宿主细胞中对宿主无关紧要但对病毒复制至关重要的蛋白，是解决病毒耐药性问题的重要途径。人源CDC样激酶1(CLK1)作为流感病毒复制过程中关键蛋白，有望成为抗流感药物新靶点。本课题将在CLK1抑制剂筛选与发现、抗流感活性评价的基础上,开展如下研究：通过建立CLK1基因敲除细胞模型和现有的CLK1过表达细胞模型，研究CLK1对病毒转录剪接因子SR磷酸化水平的影响、SR磷酸化对pre-mRNA选择性剪接和病毒蛋白表达的影响；采用细胞免疫荧光等方法，考察CLK1抑制剂对SR磷酸化，进而对pre-mRNA选择性剪接和病毒蛋白的调控作用；通过体内外实验，证实CLK1抑制剂对病毒耐药毒株的药效。以阐明CLK1及其抑制剂调控甲型流感病毒复制的机制，确证CLK1抑制剂优势，为靶向CLK1抗流感新药研发奠定理论基础。

甲型流感病毒的基因易于变异，对于靶向病毒蛋白的药物易于产生耐药性，严重威胁人类 的生命健康。选择宿主细胞中对宿主无关紧要但对病毒复制至关重要的蛋白，是解决病毒耐药性问题的重要途径。CLK1作为流感病毒复制过程中关键蛋白，CLK1及其抑制剂调控甲型流感病毒复制的机制尚不清楚。.本项目构建了CLK1过表达细胞模型，对过表达CLK1的细胞感染流感病毒，发现过表达CLK1组与空白质粒对照组相比，其细胞存活率显著下降。此外，过表达CLK1后可以显著提高流感病毒M2/M1基因表达量，而CLK1抑制剂J10688可以逆转这一效应。提示过表达CLK1后可以增强流感病毒的复制水平，增强流感病毒从M1基因到M2基因的选择性剪接。.利用基因沉默技术对A549构建CLK1基因敲除细胞模型，发现CLK1基因沉默后，上清中可感染性病毒颗粒数显著下降；同时病毒核蛋白（NP）、离子通道蛋白（M2）显著下降，说明CLK1基因沉默，可以抑制流感病毒的复制。作为CLK1抑制剂，J10688通过抑制CLK1活性，使下游的SF2/ASF、SC35蛋白磷酸化水平降低，进而影响流感病毒从M1到M2的选择性剪接，直接导致M2表达量降低，进而抑制了病毒的复制。此外，J10688还能下调HA基因的表达水平；抑制NP和M2的表达水平。以上研究揭示了CLK1调控甲型流感病毒复制的机制，证明了CLK1是流感病毒复制过程中的关键蛋白，是很有潜力的抗流感药物靶点。.体外病毒感染细胞病变实验表明，J10688不仅能够抑制H1N1、H3N2、B三类流感病毒在细胞内的复制过程，还可以抑制流感病毒的吸附过程，对细胞具有保护作用。J10688对病毒引起的细胞上清中炎症因子IL-6等的表达水平也有明显抑制作用。此外，J10688对耐药株具有很强的抑制活性，提示J10688具有很好的临床应用价值。.体内实验结果表明，J10688可显著抑制病毒感染引起的小鼠死亡，其药效与临床一线用药达菲相当。同时，J10688可改善病毒感染小鼠的异常生理生化指标，在调节机体免疫方面，其活性优于阳性药达菲。.总之本项目阐明了CLK1及其抑制剂调控甲型流感病毒复制的机制，为靶向CLK1抗流感新药研发奠定理论基础，为CLK1抑制剂J10688的进一步研发奠定基础。