短乳杆菌NCL912谷氨酸操纵子的表达调控机制

Gamma-aminobutyric acid has many biological functions. The bio-production of gamma-aminobutyric acid by lactic acid bacteria has become a new interesting biotechnology. However, there are no reports describing the components, structure and expression and regulation mechanism of glutamic acid decarboxylase system responsible for the synthesis of gamma-aminobutyric acid. We have cloned glutamic acid decarboxylase gene (gadB) and its flanking sequences from a high gamma-aminobutyric acid-producer Lactobacillus brevis NCL912. Sequence analysis showed that glutamic acid decarboxylase system may form an operon. Based on the relative research progress and applicant's prophase work, we intend to analyze the relationship of the structural genes and regulatory gene in transcriptional level; clone and identify promoter sequence; purify regulatory protein and clone its encoding gene; obtain specific DNA region binding regulatory protein and get its exact DNA sequence; construct the mutant NCL912△gadR, and compare the transcriptional level of gadCB in NCL912△gadR with that in wild strain NCL912, then analyze the control of gadR on gadCB. The goal of this project is to confirm the operon structure and explore its expression and regulation mechanism.

γ-氨基丁酸具有多种重要的生物学功能，利用乳酸菌生物合成γ-氨基丁酸已成为引人关注的新型技术。近年来有关菌种与工艺方面的研究较多，但对负责合成γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶系统的元件组成、结构及其表达调控机制，尚未见深入的工作和报道。我们前期克隆到了高产γ-氨基丁酸的短乳杆菌NCL912的谷氨酸脱羧酶基因（gadB）及其侧翼序列。序列分析表明，谷氨酸脱羧酶系统可能组成操纵子。基于对国内外相关研究进展的了解和前期研究基础，本课题拟进行以下几方面的研究，包括该系统的结构基因（gadCB）和调节基因（gadR）的转录水平；启动子的克隆与鉴定；调控蛋白的纯化及其编码基因的克隆；调控蛋白特异识别的DNA区域及其序列分析；构建突变株NCL912△gadR，并与野生菌gadCB的转录水平和γ-氨基丁酸合成能力进行比较，分析gadR对gadCB转录的调控方式。旨在证实谷氨酸操纵子结构，并探索其表达调。

背景：γ-氨基丁酸（GABA）具有多种重要的生物学功能，已被列为新资源食品。 利用食品级微生物合成GABA是未来的发展趋势。短乳杆菌NCL912发酵48 h时GABA达104g/L，具有应用前景。乳酸菌通过GABA合成系统合成GABA：谷氨酸被一种逆向转运蛋白泵入细胞，随即被胞内的谷氨酸脱羧酶（GAD）脱羧生成GABA，产物再被转运蛋白运出细胞。推测NCL912的GAD和转运蛋白协同表达，组成操纵子结构。.主要研究内容：操纵子结构解析；操纵子表达调控机制。.重要结果：1）建立了引物部分重叠PCR（POP-PCR）用于DNA步移，获取操纵子序列。2）NCL912的GABA合成系统形成谷氨酸操纵子（glu operon）结构，由两个功能基因（gadCA）和一个调节基因（gadR）组成，gadR正调控gadCA。.关键数据：1）其它短乳杆菌有两个GAD基因（gadAB），而NCL912只有gadA。2）NCL912的gadA序列与其它短乳杆菌的同源性仅为81%，整个操纵子序列的同源性更低。3）谷氨酸诱导操纵子表达，gadR与gadCA同步转录，gadCA转录量一致，gadR转录量因不同时期为gadCA的14~156倍。.科学意义：1）揭示了乳酸菌glu操纵子不仅存在种水平上的差异，而且存在菌株水平上的差异。2）乳酸菌中，目前仅阐明了乳酸乳球菌GABA合成系统组成操纵子，而其它仅涉及基因克隆研究。本项目的研究思路可为阐明其它乳杆菌GABA合成系统提供借鉴。3）POP-PCR可应用于染色体步移、基因组测序补洞与插入位点鉴定等。