高产γ-氨基丁酸短乳杆菌NCL912锰离子增强效应的遗传基础解析与改组

γ-aminobutyric acid (GABA) has a variety of biological functions, and has been listed as a new resource food. The synthesis of GABA by food-grade microorganisms will be the trend in the future. The GABA yield of Lactobacillus brevis NCL912, an our previously isolated strain, reaches 104g/L with 48 h of fermentation, showing a good application prospect. Preliminary work indicated that Mn2+ could significantly improve the GABA synthesis of NCL912 (Li, et al. Amino Acids. 2010, 38: 1439-1445), but did not affect the activity of glutamic acid decarboxylase (GAD) responsible for synthesizing GABA. We conjectured that there exist Mn2+ effect genes, and Mn2+ may play a role through regulating their differential expression. This project intends to identify the potential Mn2+ effect genes to reveal the genetic basis of the effect; shuffle the main Mn2+ effect genes, reconstruct the GABA synthesis control network based on Mn2+, and obtain a practical lactic acid bacterial cell factory; optimize extracellular factors affecting GABA synthesis to make them coordinate with the cell’s internal demand, and therefore effectively improve the efficacy of GABA production. Our goals are to accumulate data for in-depth study of the GABA synthesis regulation mechanism and stain modification; and provide the reference for resolving the genetic basis of key factors of other biological processes.

γ-氨基丁酸（GABA）具有多种生物学功能，已被列为新资源食品。 采用食品级微生物合成GABA是未来的发展趋势。本研究组分离的短乳杆菌NCL912发酵48h GABA达104g/L，具有应用前景。前期工作表明，Mn2+能显著提高NCL912的GABA合成能力（Li, et al. Amino Acids. 2010, 38: 1439-1445），但不影响负责合成GABA的谷氨酸脱羧酶(GAD)活性。推测其中存在受锰离子调控的效应基因，锰离子通过干预其差异表达发挥作用。本项目拟鉴定锰离子效应基因，揭示锰离子效应的遗传基础；对主效应基因进行改组，重塑基于锰离子的GABA合成控制网络，获取实用乳酸菌细胞工厂；优化影响GABA合成的胞外因子，使之与细胞的内在需求相协调，有效提升产物合成效率。旨在为深入研究GABA合成调控机制与菌种改造积累数据；为解析其它生物过程关键因子的遗传基础提供思路借鉴。

γ-氨基丁酸（GABA）具有多种生物学功能，已被列为新资源食品。采用食品级微生物合成GABA是未来的发展趋势。本研究组分离的短乳杆菌NCL912发酵48 h后GABA达104g/L，具有应用前景。前期工作表明，Mn2+能显著提高NCL912的GABA合成能力，但不影响负责合成GABA的谷氨酸脱羧酶(GAD)活性。推测其中存在受锰离子调控的效应基因，锰离子通过干预其差异表达发挥作用。主要研究内容与结果如下。.（1）解析了关键的锰离子效应基因是谷氨酸脱羧酶（GAD）系统的gadA、gadC基因，锰离子显著增强其表达与活性，从而增强GABA合成。.（2）通过缓释型底物谷氨酸自调控pH，重塑了细胞的代谢网络，显著增强了菌种的合成能力，发酵48 h后GABA浓度达到达205 g/L，比常规发酵方法的产量提高了1倍以上，大幅领先国际同类研究水平。.（3）建立了基因组步移技术——引物阶梯式部分重叠PCR（Stepwise partially overlapping primer-based PCR，SWPOP-PCR），用于获取已知序列的未知侧翼。技术关键是步移引物的3’端的10 bp与上一轮步移引物5’端的10 bp完全一致，仅在较低温度下能与前一轮产物的步移引物位点发生部分退火。.（4）研发了醋酸锌辅助差异沉淀/溶解（zinc acetate-assisted differential precipitation/dissolution，ZA-DPD）方法，通过逐步回收GABA以除去发酵液中的谷氨酸；在此基础上，将ZA-DPD与茚三通显色相结合，可以用于GABA高通量测定。.（5）建立了无Cu2+的洗脱预染纸色谱-分光光度法用于GABA的高通量定量。色谱纸在含茚三酮的展开剂中展开后加热显色，剪下显色斑点，置于75%的乙醇溶液中静置洗脱，在570 nm处测定光吸收值。.为深入研究乳酸菌GABA合成的调控机制与菌种改造积累了数据，并提供了技术与方法支撑。