地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶底物特异性机制及其分子改造研究

The formation of acrylamide that is a potential carcinogen from starch-based food can be controlled by L-asparaginase. Our previous studies revealed that there was significant difference in substrate specificity between L-asparaginase (BlAase) I and II from Bacillus licheniformis, as well as their degradation effect on acrylamide. Accordingly, it was supposed that the degradation effect of BlAase depended on their substrate specificity. However, the molecular mechanism of the degradation of acrylamide relating to the substrate specificity of BlAase has not yet been clarified. In this project, the crystals of BlAase I, BlAase II and their complexes with different ligands will be produced first. The function and structure of the crystals will then be explored, so as to clarify the changes in spatial configuration and key sites of enzyme substrate binding pockets. Next, the detailed molecular mechanism about substrate specificity of BlAase will be explored through structure comparison. Moreover, different methodologies, such as molecular docking and molecular dynamics simulation, will be employed to analyze the key site affecting enzyme substrate specificity and subsequently identify the targte site. Site-directed mutagenesis and iterative saturation mutagenesis technologies will also be utilzied to obtain higher substrate-specific mutants. Lastly, the factors influencing enzyme substrate specificity will be revealed through the analysis of structure-function relationship of mutants. Ovearall, the outcomes of this project can provide guidance about the molecular modification of BlAase, as well as enrich the fundamental theory of BlAase.

L-天冬酰胺酶能从根源上控制热加工食品中潜在致癌物丙烯酰胺的形成。前期研究发现，地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶（BlAase）I型和II型存在底物专一性差异，且丙烯酰胺降解率明显不同，推测其应用效果差异可能与酶的底物识别与结合能力有关，但其底物特异性的分子机制尚不清晰。本研究拟通过制备BlAase I型、BlAase II型晶体及其与配体复合物晶体，解析其结构与功能，探究酶底物结合口袋的空间构型及关键位点的变化，阐明酶底物特异性分子机制；并通过两者结构比对，揭示其底物特异性差异的分子机制。在此基础上，针对BlAase I型底物特异性差的问题，通过分子对接、分子动力学模拟等方法，分析影响底物特异性关键位点，确定靶位点，并采用定点突变和迭代饱和突变技术，获得底物特异性显著提高的突变体，结合突变体功能变化分析其构效关系，揭示影响其底物特异性的分子机制,为L-天冬酰胺酶分子改造和酶学理论提供科学依据。

L-天冬酰胺酶能从根源上控制热加工食品中潜在致癌物丙烯酰胺的形成，前期研究发现地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶（BlAase）I型和II型存在底物专一性差异，其丙烯酰胺降解率明显不同，推测应用效果差异可能与酶的底物识别和底物结合能力有关，但其底物特异性的分子机制尚不清晰。本项目首先通过对酶结晶条件的筛选、晶体条件的优化及X-射线衍射，解析了BlAase I型的三维晶体结构及其与底物、产物复合体的晶体结构，探究酶的底物结合口袋的空间构型及关键位点的变化，确定影响底物特异性的关键氨基酸位点，突变验证其功能，阐明BlAase I型底物特异性的分子机制是底物与酶活性中心的氨基酸之间的氢键相互作用力减少而导致的变化，填补了国内外BlAase I型的结构信息和在该研究领域中的空白。同时，在无法解析BlAase II型晶体结构的基础上，通过三维结构模拟、分子对接和序列比对分析BlAase II型的活性中心与底物结合口袋，确定影响BlAase II型底物特异性的关键氨基酸位点，结合功能验证，探究BlAase II型底物特异性的分子机制。其次，比较BlAase I型与BlAase II型两者之间在底物结合区域中的识别位点与键合模式、催化活性中心氨基酸构象、相互作用力以及结合能等结构信息差异，探究影响两者底物特异性差异的关键位点，并通过定点饱和突变和组合突变验证，解析了两者之间底物特异性差异的分子机制。最后，针对BlAase I型底物特异性不强的问题，基于结构分析、分子动力学模拟和多重序列比对，探究酶活性中心氨基酸残基与底物之间的相互作用，分析影响底物特异性关键位点和氨基酸残基，确定靶位点，并采用定点突变和定点饱和突变技术，获得了底物特异性显著提高的突变体。此外，比较野生型和突变体的结构差异，并结合突变体的功能变化分析其构效关系，进一步阐明了突变影响其底物特异性的分子机制，为L-天冬酰胺酶的分子改造和酶学理论提供科学依据。同时，对于提高酶的应用性能以及开发自主创新的L-天冬酰胺酶制剂，从源头上控制热加工食品中丙烯酰胺形成具有十分重要的意义。