鱼腥藻脂肪氧合酶热稳定性提高及其分子机理研究

Lipoxygenase (LOX), used in gluten strength and bleaching, plays an important role in improving flour quality, which is as a potential flour additive to substitute potassium bromate and benzoyl peroxide in flour industry. Our previous study found that the thermal stability of the recombinant Anabaena lipoxygenase (Ana-LOX) was not satisfied. As a result, based on the expression of the Ana-LOX genes, the current study was focused on improving the thermal stability and activity of Ana-LOX as well as the mechanism of its thermal stability by protein engineerng technology. We first modified the thermal stability of Ana-LOX by using directed evolution, and also estabilished the high-throughput screeing method and mutant geng library. In order to obtain mutants with advanced thermal stability and activity, we applied rational strategy of computer simulation, such as molecular dynamics simulations and B-factor value analysis. In the meantime, by combining homology modeling and molecular dynamics simulations, as well as mutant protein crystal structure and thermal stability of the relationship analysis, we illustrated molecular mechanism of improving the thermal stability of Ana-LOX. Moreover, we uncovered the relationship between the thermal stability of Ana-LOX and the corresponding enzyme structure. All these results can be used as a reference to investigate the relationship between the structure of LOX and its functions in future studies.

脂肪氧合酶(LOX)对小麦面粉具有强筋和漂白双重作用，在面粉品质改良中起重要的作用，是一种潜在的替代溴酸钾及过氧化苯甲酰的绿色面粉改良剂。在前期研究中发现重组鱼腥藻脂肪氧合酶(Ana-LOX)在面粉中应用热稳定性还不够理想。本项目在已克隆表达Ana-LOX基因的基础上，旨在通过蛋白质工程技术提高Ana-LOX热稳定性和活性，并阐明其热稳定性机理。首先采用定向进化方法对Ana-LOX热稳定性进行改造，建立Ana-LOX的高通量筛选方法和突变体文库，以及利用分子动力学模拟和B-factor值分析方法等计算机模拟的理性设计对Ana-LOX热稳定性改造，获得热稳定性与酶活同时提高的突变体；其次，通过结合同源建模和分子动力学模拟以及突变体晶体结构和热稳定性的关系分析，阐明提高Ana-LOX热稳定性分子机理，揭示Ana-LOX热稳定性与酶的结构之间的关系，为酶的热稳定性分子改良和酶学理论提供理论依据。

脂肪氧合酶(LOX)对小麦面粉具有强筋和漂白双重作用，在面粉品质改良中起重要的作用，是一种潜在的替代溴酸钾及过氧化苯甲酰的绿色面粉改良剂。在前期研究中发现重组鱼腥藻脂肪氧合酶(Ana-LOX)在面粉中应用热稳定性还不够理想。本研究首先通过重组脂肪氧合酶基因工程菌的破碎条件优化，比较了分光光度法、碘化钾-淀粉法和二甲苯酚橙法测定脂肪氧合酶活力，确定简单、灵敏、快速且测定体系具备肉眼可辨的特征颜色碘化钾-淀粉法用于LOX活性高通量筛选，建立了脂肪氧合酶热稳定性的高通量筛选体系。其次，利用易错PCR技术与DNA Shuffling相结合的方法对Ana-LOX进行分子改造，建立随机突变文库，通过高通量定向筛选，获得了热稳定性与活力提高突变体，并对突变体酶学性质进行研究，分析突变酶热稳定性提高的原因。同时，对Ana-LOX基因序列进行多序列比对，采用SWISS-MODEL对Ana-LOX进行同源建模，利用B-Fitter软件分析Ana-LOX三维结构模型PDB文件，获得B-值最高氨基酸残基，通过定点突变获得突变体文库，获得热稳定性提高突变酶，并通过突变酶结构分析，解析其热稳定性提高分子机制；并运用“Consensus Concept”技术预测待突变位点，通过建立智能型饱和突变库，结合高通量筛选方法，筛选出热稳定性提高的突变体，并对其进行突变体组合研究，获得组合突变体，进一步探究Ana-LOX热稳定性提高的分子机制。最后，通过分子动力学模拟技术手段分别模拟了Ana-LOX在298K和320K下在水溶液中的运动轨迹，计算均方根偏移与均方根涨落，以RMSF值为热稳定性评价指标，结合作用力分析预测不稳定区，并通过定点突变，验证分子动力学模拟的有效性。本研究通过定向进化和理性设计策略对Ana-LOX进行分子改造，获得热稳定性与酶活同时提高的脂肪氧合酶突变体，并利用圆二色谱对突变酶的结构进行分析，以及结合同源建模与分子动力学模拟解析，研究发现疏水作用力的引入、氢键的形成、静电相互作用加强等因素，稳定了Ana-LOX结构，从而提高其热稳定性，阐明了脂肪氧合酶热稳定性提高的机理，为研究脂肪氧合酶结构和功能的关系提供理论数据和信息。同时，首次应用分子动力学模拟技术预测Ana-LOX的不稳定区域，并验证了预测的有效性，为脂肪氧合酶分子的热稳定性改造提供了理论依据。