miRNAs靶向酪氨酸激酶Etk/Bmx调控小细胞肺癌抗药性的机制研究

小细胞肺癌化疗耐药是疗效差的主要原因。我们的先期研究发现酪氨酸激酶Etk/Bmx与小细胞肺癌的抗药性关系密切；miRNA芯片结合生物信息学分析结果提示miR-495、miR-218及miR-195对Etk/Bmx可能有靶向调控作用。为进一步明确miR-495等三种miRNA靶向Etk/Bmx调控小细胞肺癌抗药性的机制，本课题拟利用小细胞肺癌耐药细胞模型开展以下研究：(1)荧光素酶活性分析等实验验证miR-495等三种miRNA对Etk/Bmx表达的靶向调控作用；(2)基因转染增加或降低耐药细胞中三种miRNA的表达，分析调控Etk/Bmx表达对小细胞肺癌耐药性的影响；(3)基因芯片和蛋白质组学技术从mRNA和蛋白水平分析Etk/Bmx参与小细胞肺癌耐药调控的分子网络。通过本项目研究，进一步丰富小细胞肺癌耐药的分子机制，为下一步开展基于Etk/Bmx信号通路逆转小细胞肺癌耐药的研究提供依据。

化疗耐药是小细胞肺癌复发和预后差的主要原因。我们的先期研究证实酪氨酸激酶Etk/Bmx与小细胞肺癌耐药性的产生关系密切，miRNA芯片结合生物信息学分析提示miR-495、miR-218等对Etk/Bmx可能有靶向调控作用。本课题利用小细胞肺癌耐药细胞模型探讨miR-495等miRNA靶向Etk/Bmx调控小细胞肺癌抗药性的机制，主要研究结果：（1）应用qRT-PCR、免疫印迹及免疫组化技术分析小细胞肺癌细胞株和组织中miR-495和Etk/Bmx表达的关系，结果显示miR-495水平与Etk/Bmx表达有显著相关性（P<0.001），荧光素酶实验证实miR-495能直接靶向作用Etk/Bmx；进一步研究发现上调Etk/Bmx表达，EMT上皮标志分子β-catenin 表达增加，而间质标志分子Zeb-2、Twist及Vim降低，下调Etk/Bmx表达，上述EMT标志分子表达相反。（2）CCK8实验证实miR-7与小细胞肺癌的药物敏感性有关，进一步发现miR-7通过PI3K/BMX/STAT3信号通路参与SCLC耐药的调节；（3）荧光素酶实验证实miR-15/16a对Etk/Bmx有直接靶向作用，miR-15/16a通过靶向调控Etk/Bmx参与调节SCLC耐药；（4）表达谱芯片和RT-PCR分析发现增加或降低Etk/Bmx表达，自噬相关基因PFKFB4与Etk/Bmx表达呈正相关，利用免疫共沉淀（Co-IP）技术进一步证实Etk/Bmx与PFKFB4之间存在相互结合关系，Etk/Bmx通过调控PFKFB4表达，影响细胞的自噬状态和药物敏感性；荧光素酶实验证实miR-218对Etk/Bmx有直接靶向作用，miR-218靶向调控Etk/Bmx通过自噬途径影响小细胞肺癌耐药性。研究结果表明miR-495/miR-7/miR-15/16a/ miR-218通过靶向调控Etk/Bmx表达，通过EMT过程、PI3K/BMX/STAT3信号通路及自噬途径参与SCLC耐药机制的调节，通过本项目研究，进一步丰富了小细胞肺癌耐药的分子机制，为下一步开展基于Etk/Bmx信号通路逆转小细胞肺癌耐药的研究提供依据。本项目研究国内外尚未见类似报道。