PRO2000/ANCCA促肝癌细胞增殖的分子机制研究

肝细胞增殖异常是导致肝癌发生的重要原因,其确切机制目前尚未完全阐明。前期研究发现PRO2000/ANCCA有促乳腺癌、前列腺癌及肝癌细胞增殖作用，是癌细胞增殖的重要调控基因之一。本课题拟在先期研究的基础上,结合生物信息学的分析结果PRO2000/ANCCA可能是miR-106b/miR-93的靶基因,对肝癌细胞HepG2开展以下两个方面研究:(1)利用基因芯片发现PRO2000/ANCCA的可能下游调控基因，染色质-免疫吸附沉淀(ChIP)、免疫吸附共沉淀(Co-IP)及RAN干扰等技术从DNA和蛋白水平证实其靶基因及调控网络；(2)利用荧光素酶活性分析等技术验证miR-106b/miR-93对PRO2000/ANCCA在基因转录后水平的调控关系。通过本项目研究,明确PRO2000/ANCCA促肝癌细胞增殖的分子机制，进一步丰富肝癌细胞增殖的分子调控网络,同时为肝癌靶基因治疗提供新的靶点。

应用免疫组化技术研究221例人肝癌组织中PRO2000/ANCCA的表达及其临床病理意义，结果显示PRO2000/ANCCA在肝癌细胞中的表达（阳性率64.25%）显著高于癌旁肝组织，且与肝癌患者的临床进展和预后密切相关。Western blotting比较分析人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、Huh7、Hep40及人胚胎肝细胞CL-48中PRO2000/ANCCA的表达，显示肝癌细胞株中PRO2000/ANCCA表达水平明显高于胚胎肝细胞，其中以HepG2和Huh7细胞中的表达水平最高；进一步采用RNA干扰和基因转染技术分别建立PRO2000/ANCCA稳定低表达细胞（HepG2和Huh7）及高表达细胞（CL-48）；通过细胞增殖实验、平板克隆、软琼脂克隆形成、划痕实验、transwell迁移及matrigel侵袭等实验体外分析PRO2000/ANCCA对肝癌细胞增殖和迁徙侵袭的影响，结果显示PRO2000/ANCCA高表达能促进细胞的增殖、迁移及侵袭；流式细胞仪检测发现PRO2000/ANCCA高表达能促进G1期向S期转换；体内动物实验发现PRO2000/ANCCA有促进肝癌生长的作用。基因表达谱芯片分析沉默HepG2中PRO2000/ANCCA表达后，细胞增殖相关基因表达谱的变化，结果提示E2F2可能是PRO2000/ANCCA相关的细胞周期基因；RNA干扰技术沉默HepG2和Huh7中PRO2000/ANCCA的表达，E2F2的表达也出现相应的减少；裸鼠瘤体和人肝癌组织中E2F2的表达与PRO2000/ANCCA呈正相关关系；免疫吸附共沉淀实验进一步明确ANCCA对E2F2有直接调控作用。生物信息学技术预测miR-106b、miR-93、miR-373及miR-372可能是PRO2000/ANCCA的潜在靶基因，miR-372可显著抑制PRO2000/ANCCA的表达，miR-372在人肝癌组织中的表达与PRO2000/ANCCA呈负向相关关系，荧光素酶报告检测证实miR-372对PRO2000/ANCCA有直接靶向调控作用。另外，我们还发现miR-372能抑制肝癌细胞增殖，与肝癌病人的肿瘤进展及预后相关。