抗卵巢癌融合蛋白IL-12-6B11ScFv的真核表达及功能研究

抗独特型抗体肿瘤疫苗，在国外已进入II、III期临床试验。在国内，我中心率先制备出自主知识产权的抗独特型单抗6B11，研究表明其能够模拟卵巢癌抗原，诱导机体产生特异性抗卵巢癌细胞免疫和体液免疫。.IL-12是目前发现的对体内免疫细胞作用最强、最广的细胞因子，主要作用于T和NK，促进CTL和LAK活性，提高IFN-γ和IL-2生成，有明显的抗肿瘤作用，与IL-2和IFN-γ相比，抗瘤效应更强，而且毒副作用低。.本课题采用基因工程技术成功将6B11ScFv与鼠IL-12融合，实现了融合蛋白的真核表达并将继续深入研究融合蛋白的体内外功能。预期融合蛋白中6B11发挥特异性抗卵巢癌作用，而IL-12一方面充当佐剂增强6B11的稳定性和免疫原性，另一方面作为协同分子，激活NK细胞、促进IFN-γ和TNF-α分泌，发挥独立的抗肿瘤作用。.本研究将为IL-12-6B11ScFv的进一步应用提供实验依据。

目的：.6B11是我中心制备的卵巢癌抗独特型单抗，能够模拟卵巢癌抗原CA166-9，诱导机体产生特异性抗卵巢癌细胞免疫和体液免疫。IL-12是目前发现的对体内免疫细胞作用最强、最广的细胞因子，主要作用于T和NK，促进CTL和LAK活性，提高IFN-γ和IL-2生成，有明显的抗肿瘤作用。本研究采用基因工程技术将6B11单链可变区基因与鼠IL-12融合并进行真核表达，深入研究融合蛋白的免疫及生物学功能，为临床应用提供实验依据。.方法：(1).利用PCR方法构建融合基因mIL-12（p40-p35）-6B11ScFv(VH-VL) 真核表达载体pSecTaq2B和pSBI。.(2).pSecTaq2B转染CHO，筛选阳性克隆，扩大培养，诱导表达，建立稳定表达细胞株。.(3).pSBI转染293EBNA细胞，诱导6B11ScFv –mIL-12融合蛋白的瞬时高效表达，亲和层析纯化表达蛋白。.(4).Elisa和western blot检测表达蛋白免疫活性。(5).混合淋巴细胞增殖实验，淋巴细胞表型分析，肿瘤细胞杀伤实验检测融合蛋白体外生物学活性。.(6).C57BL/6J小鼠卵巢癌皮下荷瘤模型体内免疫，观察融合蛋白体内抗卵巢癌的功能。结果： .(1).成功构建了真核表达载体pSecTag2B/6B11ScFv-mIL-12和pSBI/6B11ScFv -mIL-12。.(2).建立了6B11ScFv –mIL-12稳定表达的CHO细胞株。(3).实现了6B11ScFv –mIL-12在293EBNA细胞的瞬时高效表达。.(4).体外免疫学活性实验表明6B11ScFv –mIL-12具有6B11ScFv和mIL-12的双重免疫活性，能够特异结合卵巢癌单克隆抗体COC166-9及兔抗小鼠IL-12抗体。.(5).体外生物学活性实验表明，6B11ScFv –mIL-12能够刺激PHA活化的淋巴细胞增殖；增加NK细胞比例，诱导LAK活化；诱导IFN-r生成增加；活化的淋巴细胞 对CA166-9阳性的肿瘤细胞具有特异的杀伤作用。.(6).体内功能研究表明，6B11ScFv–mIL-12融合蛋白能够抑制C57BL/6J小鼠卵巢癌ID8皮下瘤的生长。结论：.6B11ScFv-mIL-12融合蛋白具有6B11和mIL-12双重免活性，有可能作为抗独特型疫苗用于卵巢癌的主动免疫。