星虫铁结合蛋白基因的真核表达及富铅功能的解析

铅对儿童的健康危害很大, 主要是影响大脑发育, 损坏神经系统的许多功能。而且这种损伤还具有不可逆转性, 因此铅中毒已经成为影响儿童健康的重要医学问题。课题组前期研究发现：星虫具有明显的富集重金属能力， Cd2+富集顺序为体壁>后肾管>内脏团>血液；Pb2+为体壁>内脏团>血液>后肾管。Cd2+的富集能力最强，其次为Pb2+，Hg2+和As3+为低富集。而重金属对星虫的致死浓度随着环境离子浓度的增加而成倍数上涨。为进一步挖掘星虫功能基因的潜力，本项目通过研究ferritin基因的甲醇营养型酵母系统的高效表达，重组蛋白的免疫磁珠分离纯化，蛋白晶体的制备，选择最佳含铅配体、利用重组铁结合蛋白特殊网状孔道富集铅，利用X-ray、原子力显微镜、圆二色光谱等检测富集Pb+2后该蛋白结构的动态变化，根据ICP-MS检测富集铅量，筛选最佳富集的条件，解读富铅机理；为今后用于治疗儿童铅中毒奠定基础。

可口革囊星虫（Phascolosoma esculenta Chen et Yeh）俗称海丁、土笋、沙虫等。该动物营穴居生活、栖息于河口、港湾以及地表径流丰富的泥沙或砂泥质滩涂中，以底栖硅藻和有机碎屑为食，其结构简单，却对盐度、重金属和温度的适应范围非常广，在恶劣的环境中能生长良好，这与其抗性很强有关，它可抗低温、高温、缺氧和重金属等。.本研究以可口革囊星虫为研究对象，对课题组已克隆获得的铁结合蛋白基因，依据相应的氨基酸序列，对其编码蛋白的信号肽、跨膜区以及磷酸化位点和疏水性等进行分析，采用CLUSTAL W程序进行多序列比对，构建进化树，对可口革囊星虫铁结合蛋白的分子进化和系统发育进行了研究；利用毕氏酵母构建铁结合蛋白真核表达体系并进行了大量表达；研究了铁结合蛋白在体外富集重金属离子后的光谱特征。其次，将铁蛋白分别用相同浓度的不同重金属进行处理，让其充分吸附重金属后，利用扫描电镜观察其富集不同重金属后的聚集形貌特征，再利用透射电镜观察其富集不同重金属后的超微结构的变化，并通过原子力显微镜检测其纳米级形貌的区别。将天然的马脾铁结合蛋白进行相同的处理，观察重组铁结合蛋白的天然铁结合蛋白的区别。将不同处理的重组铁蛋白和天然铁蛋白用傅里叶变换红外光谱检测其富集不同重金属后蛋白基团的变化，再用圆二色光谱检测铁蛋白空间结构的变化。用EDS进一步证实了铁结合蛋白具有富集不同重金属的能力，在经过重金属处理的蛋白里均检测到了相应的重金属，对铁结合蛋白富集重金属进行了定性的检测；ICP-MS的结果对蛋白富集重金属的能力进行了定量的检测。也利用了2株细胞研究了它的解毒功能。.研究结果显示：铁蛋白富集重金属Fe3+的能力最强，富集有毒重金属离子如Pb2+、Cd2+能力次之，而对低毒重金属几乎无富集作用。重组铁蛋白富集重金属的能力远远高于马脾铁蛋白组，仅以Fe3+和Pb2+为例，二者就相差约30倍和21倍。而细胞实验也进一步表明了铁结合蛋白能够通过吸附Pb+2来保护小鼠成骨前体细胞MC3T3，使细胞的死亡率明显降低（P<0.05）。铁蛋白调节一些特殊蛋白质合成、能量代谢和氨基酸代谢保护MSCs免受Cd+2 损伤。