TLR4/SFKs 介导糖尿病肺部感染旁细胞途径对通透性调节作用的研究

糖尿病患者术中机械通气所致肺损伤是其围术期肺部感染的主要原因之一。本课题建立糖尿病机械通气肺部感染模型，探讨机械通气相关性肺炎与LPS肺部感染的关系；观察TLR4基因突变小鼠诱发糖尿病机械通气后，和TLR4 siRNA表达载体转染人肺微血管内皮细胞，在高糖状态下LPS处理后，内皮细胞通透性的变化，磷酸酪氨酸免疫定位，及PTK,PTP和ZA蛋白表达变化。通过分析体内和体外TLR4/SFKs介导糖尿病肺部感染的肺微血管内皮细胞旁细胞途径开放对通透性的调节作用，为临床防治糖尿病患者围术期肺部感染提供新的方法和理论依据。

目的：糖尿病患者术中机械通气所致肺损伤是其围术期肺部感染的主要原因之一，探讨体内糖尿病机械性通气小鼠TLR4信号旁细胞途径对肺微血管内皮细胞通透性的影响，体外TLR4配对Src酪氨酸家族激酶（SFKs）信号通路介导的高糖状态下LPS诱导的人肺微血管内皮细胞旁细胞途径及其对通透性的影响。方法：建立糖尿病机械通气肺部感染模型，采用腹腔注射链脲佐菌素150mg／kg的方法制备糖尿病模型。取糖尿病模型制备成功的小鼠进行机械通气4h。Toll样受体4基因突变型小鼠C3H/HeJ及野生型小鼠C3H/HeN，对比观察TLR4mRNA，磷酸酪氨酸蛋白，VE-钙粘蛋白和ß-连环蛋白的表达和肺微血管通透性。构建TLR4siRNA表达载体，转染人肺微血管内皮细胞（HPMSC）。采用荧光标记siRNA技术分析siRNA稳定性和转染效率，正常HPMSC细胞和TLR4siRNA转染组在高糖状态下LPS处理后，[14C]-BSA通过量评价内皮细胞通透性，免疫荧光法对微血管内皮细胞磷酸酪氨酸免疫定位，免疫共沉淀证实磷酸酪氨酸蛋白VE-钙粘蛋白和ß-连环蛋白，Western blot分析PTK，PTP和ZA蛋白表达，RT-PCR法分析TLR4mRNA表达。结果：与Sham组比较，DM组PaO2降低，肺组织W／D比、MPO活性、肺微血管通透性升高，NF-KB p65表达上调，磷酸酪氨酸蛋白，VE-钙粘蛋白和ß-连环蛋白表达增加。与C3H/HeN小鼠相比，DM组C3H/HeJ小鼠PaO2降低，肺组织W／D比、MPO活性、肺微血管通透性增加，TLR4mRNA，磷酸酪氨酸蛋白，VE-钙粘蛋白和ß-连环蛋白表达降低。双酶切及测序证实重组载体构建成功，体外实验表明，HPMSC细胞中TLR4mRNA及蛋白水平均降低，TLR4siRNA抑制LPS对MIP-2表达的上调作用，LPS对p38-MAPK及ERK1/2的活化作用亦被TLR4siRNA下调。免疫荧光分析显示TLR4siRNA转染HPMSC中β-连环蛋白和血管内皮-钙粘附素的分布由细胞膜的特异性分布转变为弥散性分布，VE-钙粘蛋白表达减少，内皮细胞通透性增加。结论：TLR4siRNA可有效调控LPS诱导的糖尿病机械性通气信号通路；TLR4/SFKs信号通路启动旁细胞途径增加肺微血管内皮的通透性。.