肝癌细胞内基因和蛋白类肿瘤标志物的单细胞、单分子荧光检测

It makes great sense to carry out early diagnosis and treatment of liver cancer. In this study, we will develope an ultrasensitive single-molecule detection method for tumor markers (genes and proteins) in single HepG 2 cells using a combination of total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) and micro-fluid chip. With this method, the Alpha-fetoprotein mRNA、mir-18 in microRNA families will be analysed quantitatively at single molecule level in single cells.Single-molecule detection of spatially variation of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) at the living cell surface will also be carried out during the apoptosis induced by anti-cancer drug. The method developed in this research requires less sample, has high detection sensitivity and can implement high-throughput single-cell analysis. We hope this study can make improvement in the early diagnosis and treatment of liver cancer and provide effective method for the prewarning of tumor.

肝癌是恶性肿瘤中常见且难以早期发现的一种，开展肝癌的早期诊断和治疗意义重大。我们拟利用激光诱导荧光全内反射显微术结合微流控芯片技术，开展肝癌细胞内基因和蛋白类肿瘤标志物的单细胞、单分子水平荧光检测方法研究，进行单个肝癌细胞内肿瘤相关抗原甲胎蛋白AFP mRNA、miRNA家族中mir-18的单分子荧光检测，单分子水平实时研究抗肿瘤药物诱导细胞凋亡过程中细胞膜表面肿瘤坏死因子受体时空变化。本项目所发展的单细胞内单分子检测方法具有检测灵敏度高、耗样量少、通量大的特点，我们期望基于此项研究能够在肝癌的早期诊断上取得进步，并进一步为肿瘤的预警和早期诊治提供新的有效方法与途径。

癌症的早期诊断是癌症治疗和愈后的关键，肿瘤标志物的存在或变化可以提示肿瘤的性质。因此开展单个细胞内肿瘤标志物的高灵敏检测甚至单分子检测具有重要意义。本项目即针对此目标，发展了针对肝癌及相关肿瘤细胞内多种蛋白类、基因和活性小分子类肿瘤标志物的高灵敏甚至单分子水平检测方法，对肿瘤细胞内膜蛋白、多种miRNA，葡萄糖、重要金属离子，ROS及GSH等生物硫醇进行了检测，并且对肿瘤凋亡过程等生物事件中多种肿瘤标志物的时空变化进行监控。项目在肝癌细胞内肿瘤标志物单细胞、单分子测定方面取得了阶段性的研究成果。主要研究内容包括：（1）设计构建了多种微流控芯片检测系统，发展了单细胞的连续进样及多激光诱导多通路荧光检测方法，实现了缺糖缺氧条件单个肝癌细胞高通量捕获及葡萄糖的单分子测定；实现了单个肝癌细胞内难以分离的钠钾的同时测定及超氧和NO的同时测定；利用微液滴实现了单细胞上肿瘤标志物膜蛋白的信号扩增和高灵敏检测，为进一步的单分子检测提供了基础。（2）设计组装了结合多种纳米材料和DNA反应的荧光传感系统，对肿瘤细胞内铜锌等重要的金属离子及多种miRNA进行信号扩增及高灵敏的活细胞成像，研究了肿瘤细胞内此类标志物在不同条件下时空分布；（3）基于多种纳米材料构建了针对肿瘤的多种载药系统，实现了近红外光刺激下药物可控释放。以上成果不仅有效提高了肝癌相关肿瘤标志物检测的准确度与灵敏度，而且对肝癌及其它癌症的早期诊断和治疗具有一定的意义。相关工作已在Chem. Sci., Anal. Chem., Chem. Commun., Biosens. Bioelectron.等期刊上发表论文12篇, 影响因子大于5.0的文章11篇，其中申请人作为第一作者的10篇。