Erk1/2-PKM2调控的“瓦伯格”效应在脾虚促进大鼠肝癌发生中的作用

Traditional Chinese medicine considers that spleen deficiency can promote the occurrence of liver cancer. However, the molecular mechanism has hardly been studied by modern medicine. Recently the traditional Chinese medical research suggested that the enhancement of glycolysis is shown in spleen deficiency. And the enhancement of glycolysis is called as "Warburg effect". And the results show that the Erk1/2-PKM2 regulated Warburg effect is closely related to the formation of liver cancer and tumor size. Therefore, the applicant supposes that upregulation of Erk1/2 promotes PKM2 into the nucleus, the Warburg effect and liver cancer.The research contents include: Based on the construction of rat liver cancer model with spleen deficiency, evaluation of the tumor formation rate, tumor size and survival time, and analyze the correlation with spleen deficiency points; using Western blot, immunofluorescence and fluorescence quantitative PCR method for evaluation of Erk1/2-PKM2 regulation Warburg effect in liver cancer model with spleen deficiency ; using inhibitor resveratrol to attenuate Warburg effect, and assess the impact on liver cancer model with spleen deficiency. The application is good for the modern medicine to explain the theory of traditional Chinese medicine treatment of liver cancer from the spleen deficiency, and provides a new research ideas and perspectives.

中医认为脾虚促进肝癌发生，但现代医学就其机理研究较少。近年中医研究表明脾虚表现为糖酵解加强，而糖酵解加强的现象在肿瘤学被称为“瓦伯格”效应，且研究表明Erk1/2-PKM2调控的“瓦伯格”效应与肝癌形成及瘤体大小密切相关。因此，申请人提出“脾虚上调Erk1/2促进PKM2入核，促进“瓦伯格”效应，从而促进肝癌发生”的研究假设。基于此的研究内容包括：①构建大鼠脾虚肝癌模型，从脾虚积分、成瘤率、肿瘤大小等方面评估脾虚对肝癌发生的促进作用；②以分子生物学、酶学、免疫学等方法研究脾虚肝癌模型Erk1/2-PKM2调控的“瓦伯格”效应，评估脾虚对“瓦伯格”效应的促进作用；③“瓦伯格”效应抑制剂处理脾虚肝癌模型，从成瘤率、肿瘤大小等方面分析抑制“瓦伯格”效应对脾虚促进肝癌发生的影响。本申请为中医“脾虚促进肝癌发生”的理论提供机理研究和实验依据，为现代医学阐释中医从脾虚论治肝癌的理论提供新的思路和视角。

中医认为脾虚促进肝癌发生，但现代医学就其机理研究较少。本项目从“瓦伯格”效应角度研究脾虚促进肝癌发生的分子机理，旨在证明脾虚通过Erk1/2-PKM2调控的“瓦伯格”效应促进肝癌的发生。围绕此研究目的，开展如下研究：①动物模型构建与评估：以大黄灌胃和以小承气汤为基础的多因素法等2种方法构建大鼠脾虚模型，以体重曲线、脾虚积分、胸腺指数和D-木糖醇吸收实验等方法对脾虚模型进行评估；以大黄+DEN灌胃构建脾虚结合大鼠肝癌模型，以体重曲线、脾虚积分、胸腺指数等方法评估在大鼠肝癌模型基础上构建脾虚模型成功。②脾虚对肝癌发生的促进作用：以HE染色、改良Masson染色、Western blot检测肝纤维化的标志分子α-SMA蛋白水平、血清ALT水平检测肝功能等方法，研究脾虚对DEN致大鼠肝癌癌前损伤的促进作用；以肝外观观察、HE染色、Western blot检测肝癌标志分子AFP和PCNA等蛋白水平、血清ALT和AST水平检测肝功能等方法，研究脾虚对DEN致大鼠肝癌发生的促进作用。③对各模型的Erk1/2-PKM2调控的“瓦伯格”效应的评估：非靶向代谢组学分析技术，对正常组大鼠、DEN处理大鼠、脾虚大鼠和脾虚+DEN处理大鼠肝组织的糖代谢情况进行研究。再通过乳酸水平检测实验和异柠檬酸脱氢酶活性实验进一步证明“瓦伯格”效应。Western blot法对p-Erk1/2、PKM2、HIF1α等的蛋白水平进行检测。④抑制“瓦伯格”效应，评估对脾虚促进肝癌发生的影响：以PKM2抑制剂（白藜芦醇）干预脾虚+DEN处理大鼠，通过乳酸水平检测证明白藜芦醇对“瓦伯格”效应的抑制作用。通过HE染色、Masson染色、α-SMA水平检测、肝功能检测、肝癌发生标记分子蛋白水平等进一步研究抑制“瓦伯格”效应，对脾虚促进DEN致大鼠肝癌的影响。通过上述研究，本项目证实：① 脾虚大鼠的肝组织中发生了“瓦伯格”效应（糖酵解水平升高，糖有氧氧化水平降低）。②脾虚促进了DEN致大鼠肝癌的癌前损伤。③脾虚促进了DEN致大鼠肝癌的发生。④脾虚促进DEN致大鼠肝癌的Erk1/2-PKM2介导的“瓦伯格”效应。⑤抑制“瓦伯格”效应可削弱脾虚对DEN致大鼠肝癌的促进作用。本项目为中医“脾虚促进肝癌发生发展”的理论提供机理研究和实验依据，为现代医学阐释中医从脾虚论治肝癌的理论，提供新的研究思路和视角。