以ROCK/MLCK为靶点探讨参苓白术散抗炎症性肠病的作用及调控肠粘膜屏障的机制

脾气亏虚乃炎症性肠病（IBD）发病的关键，肠黏膜屏障功能异常是其发病的病生基础。肠上皮细胞的细胞骨架结构、紧密连接（TJ）定位、蛋白表达水平变化与肠黏膜屏障功能有重要关系。氧化应激介导相关信号转导调控及Rho激酶（ROCK）/肌球蛋白轻链激酶（MLCK）磷酸化可致TJ功能障碍。本课题将在IBD动物模型研究氧化应激介导PKC、Ca2+/CaM活性改变使ROCK/MLCK磷酸化，从而引起细胞骨架结构改变与肠黏膜屏障功能受损；以肠上皮细胞、肠上皮内淋巴细胞以及共培养体系研究ROCK/MLCK磷酸化、MAPK、ERK、NF-κB等信号转导途径与肠黏膜屏障受损的关系；通过动物与细胞实验,以ROCK/MLCK为靶点探讨益气健脾、渗湿止泻的 "参苓白术散" 抗IBD作用与肠道黏膜屏障功能及其相关信号转导调控关系，为拓展参苓白术散在IBD的应用提供新的理论及实验依据，为中医药防治IBD提供新思路。

背景：本课题探讨参苓白术散抗炎症性肠病（IBD）与Rho/Rho激酶、MLCK及上、下游信号转导通路与细胞骨架、通透性及调控肠粘膜屏障的关系。.主要内容与结果：在5% DSS诱导小鼠IBD模型中，与正常组相比，模型组结肠黏膜病理改变明显，组织中ROS、MPO、MDA、二胺氧化酶（DAO）水平升高，尿液中甘露醇与乳果糖排出率比值升高，上调ROCK/MLCK、MAPK、ERK 、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白或mRNA水平，下调Claudin、JAM、Occludin、ZO-1mRNA水平。不同剂量的参苓白术散组改善IBD结肠病变，降低DAO、ROS、MPO、MDA含量及尿液中甘露醇与乳果糖的排出率比值，下调ROCK/MLCK、MAPK、ERK 、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白或mRNA水平，上调Claudin、JAM、Occludin、ZO-1mRNA表达。.在培养的IEC-6细胞中，不同浓度参苓白术散含药血清及各抑制剂组降低LPS诱导的IL-1、IL-6、TNF-α含量及Ca2+浓度、抑制细胞凋亡，下调ROCKⅡ和 TNF-α mRNA、ROCKⅡ、MLCK 、p44/p42ERK1/2和P38MAPK蛋白水平，上调JAM、ZO-1和Claudin-2mRNA表达；显著升高IEC-6细胞的跨膜电阻（TEER），降低细胞通透性，细胞的应压纤维排列有序紧密。. 在培养的淋巴细胞cyc-tag中，与LPS组相比，不同浓度参苓白术散含药血清与抑制剂组降低LPS诱导的ROCK/MLCK与磷酸化的ROCK/MLCK蛋白表达；升高cyc-tag细胞的跨膜电阻（TEER），降低细胞通透性，使cyc-tag细胞的应压纤维排列有序紧密。. 在肠上皮-淋巴细胞共培养体系中，与LPS组相比，不同浓度参苓白术散含药血清与抑制剂组下调LPS诱导的ROCK/MLCK与磷酸化的ROCK/MLCK蛋白表达量；升高细胞间的跨膜电阻（TEER）显示参苓白术散能够改善细胞共培养体系中肠上皮-淋巴细胞的细胞间通透性。.课题研究提示参苓白术散明显改善IBD病变，与抑制p38MAPK、ERK、ROCK、MLCK信号转导途径的激活、抑制炎症、改善肠道组织粘膜屏障的TJ与缝隙连接、调节细胞骨架及改善细胞通透性水平有关。