基于肠上皮细胞自噬及调控通路探讨参苓白术散治疗炎症性肠病的作用机制

Inflammatory bowel disease (IBD) occurred in the course of intestinal epithelial permeability increased and impaired barrier function is the pathophysiological basis, while maintaining mucosal barrier of intestinal epithelial cell and homeostasis become treatment IBD key. Spleen qi deficiency, dampness accumulation is the pathogenesis of IBD key, the research found that Qi and spleen, wet permeability of diarrhoea of classical prescriptions Shenlingbaizhu powder by regulating F-actin and maintain the cell skeleton structure, improve the permeability of intestinal mucosa in treatment of IBD, and the effect of inhibition of Rho kinase A (RhoA), MAPK pathway, ERK1/2 pathway phosphorylation. These pathways and autophagy or homeostatic maintenance is closely related, autophagy gene Atg16L1 play an important role in IBD, while RhoA regulated F-actin is involved in the regulation of autophagy, PI3K-Akt-mTOR is the main pathway of autophagy. This project will combined with the IBD animal and cell models, confirm the causal relationship between autophagy of intestinal epithelial cells and IBD, PI3K-Akt-mTOR/mTOR independent regulation to them, to explore the relationship between Shenlingbaizhu powder treatment of IBD and intestinal epithelial cell autophagy and the regulation mechanism, provides the new mentality, the new target for the treatment of IBD.

炎症性肠病(IBD)发生中肠上皮细胞通透性增加及屏障功能受损是其病生基础，而维系肠上皮细胞粘膜屏障功能、内环境稳态成为治疗IBD关键。脾气亏虚，湿邪内蕴是IBD发病关键，前期课题发现益气健脾，渗湿止泻的经方参苓白术散通过调节肌动蛋白（F-actin）维系细胞骨架结构，改善肠粘膜通透性治疗IBD，该作用与抑制Rho激酶A（RhoA）、MAPK通路、ERK1/2等通路磷酸化有关。此通路与自噬及内环境稳态的维系密切相关，自噬执行基因Atg16L1在IBD中发挥重要作用，而RhoA调控F-actin参与自噬过程，PI3K-Akt-mTOR是细胞自噬最主要的调控通路。本项目拟在前期基础上，结合IBD动物与细胞模型，求证PI3K-Akt-mTOR依赖/mTOR非依赖途径调控的肠上皮细胞自噬与IBD之间的关系，探讨参苓白术散治疗IBD与肠上皮细胞自噬的关联及调控机制，为IBD的治疗提供新思路、新靶点。

在5%DSS方法复制炎症性肠病（IBD）小鼠模型中，与正常组相比，模型组肠道溃疡及炎症反应明显，血清中IL-10含量降低，IL-8含量升高，肠组织中IL-1β和TNF-α的表达明显升高（P<0.05）；模型组LC3A/B阳性较少，LC3-II含量明显降低，极少量自噬发生，F-actin表达较弱；不同剂量的参苓白术散显著减轻肠道组织溃疡及炎症，减少IL-1β、TNF-α表达、IL-8含量，升高IL-10含量，提高自噬水平及F-actin表达。模型组肠组织中PI3K、mTOR、p62磷酸化与ULK1蛋白表达升高，Beclin1磷酸化程度及4EBP蛋白表达降低（P<0.05）；不同剂量的参苓白术散显著降低PI3K、mTOR、p62磷酸化程度与ULK1蛋白表达，升高Beclin1磷酸化程度及4EBP蛋白表达（P<0.05）。模型组肠组织中Atg5,12，13,16，ULK1mRNA与正常组相比有明显降低（P<0.05），而参苓白术散主要通过上调Atg16mRNA来改变自噬的调节（P<0.05）。.在培养的IEC-6细胞中，采用100ug/ml LPS作为炎症的刺激因素。与空白组比较，模型组TNF-、IL-1、IL-8浓度上升的同时p62、Akt、PI3K、mTOR、4EBP1蛋白磷酸化水平升高（P<0.05）；参苓白术散含药血清与各阻断剂组显著降低TNF-、IL-1、IL-8浓度与相关通路蛋白表达量（P<0.05）；模型组LC3II、beclin1、ULK1、P70S6K蛋白磷酸化降低（P<0.05），参苓白术散含药血清与各阻断剂组显著升高及相关通路蛋白的磷酸化水平（P<0.05）。模型组中ATG5、ATG13、ATG1612 mRNA水平降低（P<0.05），自噬体斑点减少，自噬活力显著下降；参苓白术散含药血清组与自噬诱导剂雷帕霉素组ATG5、ATG13、ATG1612 mRNA水平增加（P<0.05）, 自噬斑点的形成明显增多。模型组F-actin明显减少，细胞形态改变明显，参苓白术散含药血清组细胞形态有了很大的的改善， F-actin明显增多。.本研究提示参苓白术散可以明显地抑制IBD的炎症表现与其减少促炎因子的表达，调节组织中肌动蛋白F-actin表达，增加自噬水平与调节自噬相关通路PI3K/AKT/mTOR及自噬基因有关。