gltA基因通过谷氨酸代谢途径调控粪肠球菌生物膜的分子机制研究

Enterococcus faecalis (E. faecalis) is a prominent pathogen causing root canal treatment failure. The inherent ability of E. faecalis to survive in endodontically treated teeth and forming biofilm has made it eradication challenging. In the previous studies, we got four clinical isolates that showing the ability to forming much more biofilm than the Enterococcus faecalis ATCC V583. Digital Gene Expression Profiling (DGE) indicating that the nitrogen metabolism pathway has significant difference between the clinical isolates and V583 strain. The expression of gltA gene encoding glutamate synthase was up regulated significantly. Glutamate synthase is the key molecule in glutamate metabolism. The gltA gene and glutamate metabolism pathway may play a role in the biofilm formation of Enterococcus faecalis. But the molecular mechanisms of this process are still unknown. This study will investigate the expression profile of gltA gene during biofilm formation of Enterococcus faecalis by Realtime PCR and Western blot, in mRNA level and protein level respectively. Then the effects of up or down regulation of gltA gene expression on the biofilm formation of Enterococcus faecalis by Knock in or Knock out methods will be assessed. The genome-scale molecular changes will be screened out using DGE sequencing. HPLC/MS will be used to examine the glutamate metabolites changes between the gltA Knock in or Knock out strains. Finally, the transcript factor regulating gltA expression will be analyzed by bioinformatics analysis and be confirmed with EMSA and ChIP technology. By these experiments, the relationship between gltA gene expression and Enterococcus faecalis biofilm formation will be confirmed, and the possible molecular mechanism of gltA gene and glutamate metabolism pathway on biofilm formation will be elucidated. The findings in this research will provide us new targets or methods to develop novel anti-biofilm bactericidal and inhibitory agents.

粪肠球菌大量增殖并形成生物膜是根管治疗失败的主要原因之一。申请者前期研究从难治性根尖周炎患牙根管中获得4个生物膜形成能力显著增高的粪肠球菌临床分离菌株。进一步的基因表达谱测序研究发现，氮代谢通路的表达与对照组相比有显著性差异，其中编码谷氨酸合成酶的gltA基因表达显著上调，它是谷氨酸代谢途径中的重要分子。提示gltA基因及谷氨酸代谢途径在粪肠球菌生物膜形成中可能发挥重要的调控作用。本项目拟在此基础上，深入研究gltA基因在粪肠球菌生物膜形成过程中的表达状态，明确其表达变化对粪肠球菌生物膜形成的影响，进而筛选其相互作用的上下游分子，揭示gltA基因及谷氨酸代谢途径在调控粪肠球菌生物膜中的作用和机制，阐明其调控细菌生物膜形成的功能意义。这些研究可以提高我们对细菌生物膜调控的认识，为研发新型抗细菌生物膜药物和抑制剂提供可能的靶位和靶通路；还可以发现粪肠球菌生物膜调控的新机制，具有重要的理论意义。

本研究的目的在于阐明E. faecalis中谷氨酸合酶相关基因gltA与生物膜形成的关系。通过对临床分离出的4株高生物膜形成能力的E. faecalis的高通量测序分析，发现gltA基因的表达量显著上调；利用实时定量PCR和非标记蛋白质谱定量检测等方法阐明gltA基因与生物膜的形成存在重要的关系；最后，构建gltA基因缺失和高表达菌株，分析其对生物膜形成的影响并讨论可能存在的分子机制。.结论如下：1、编码谷氨酸合酶的gltA基因表达显著上调。这是首次发现gltA基因及谷氨酸代谢途径在E. faecalis生物膜形成中发挥重要的调控作用。2、4株高生物膜形成能力的E. faecalis中gltA基因在6h和12h的表达量显著高于对照组；非标记蛋白质谱定量结果显示，GOGAT的含量在6h时显著高于对照组，而12h时两者无统计学差异，24h时则均未检测到蛋白含量。证明gltA基因的高表达能增强E. faecalis的生物膜的形成能力，还说明，gltA基因编码GOGAT能在生物膜形成的早期阶段通过调节新陈代谢所必需的大分子谷氨酸，对生物膜的生物量产生影响。3、成功构建gltA基因缺陷和高表达菌株。LSCM结果显示gltA基因高表达菌株生物膜形成较快，结构致密，厚度增加明显，而gltA基因缺陷菌株生物膜形成较慢，结构松散，厚度下降明显。生物膜形成相关基因gelE、fsrB、esp、ace、salB和bopD的表达量在gltA基因高表达菌中均显著增高，而在gltA基因缺陷菌中则显著降低。gltA编码GOGAT合成的谷氨酸，是E. faecalis体内众多大分子结构的骨架分子，如肽聚糖。肽聚糖同样是菌体细胞壁的重要组成成分，因此认为gltA基因可能是通过影响E. faecalis细胞壁中的肽聚糖的合成影响了细菌表面结构发生变化，从而改变了生物膜的形成能力。.该研究第一次明确了gltA基因与E. faecalis生物膜之间的关系，初步揭示了gltA基因及谷氨酸代谢途径在调控E. faecalis生物膜中的作用，阐述了其在调控生物膜形成的潜在机制。这些研究可以提高我们对E. faecalis生物膜调控的认识，为研发新型抗细菌生物膜药物和抑制剂提供可能的靶位和靶通路，还可以发现E. faecalis生物膜调控的新机制，具有重要的理论价值。.