bfrg在粪肠球菌生物膜形成中的作用及分子机制研究

Multi-species bacterial infection is the key factor in oral infectious diseases. Enterococcus faecalis (E. faecalis) is a prominent pathogen causing root canal treatment failure. The inherent ability of E. faecalis to forming biofilm has made it eradication challenging in endodontically treated teeth. Previous studies have shown that the mutation of bfrg gene lead to dramatic decrease in the amount of biomass of Enterococcus faecalis biofilm. Indicating that bfrg gene plays a role in the biofilm formation of Enterococcus faecalis. But the molecular mechanisms of this process are still unknown. This study will investigate the expression profile of bfrg gene during biofilm formation of Enterococcus faecalis by Realtime PCR and Western blot. Then assess the effects of up or down regulation of bfrg gene expression on the biofilm formation of Enterococcus faecalis by Knock in or Knock out methods. Finally, using Co-Immunoprecipitation method coupled with mass spectrometry technology and gene expression microarray technology, the molecules that interact with BFRG protein will be screened out, and the possible modulation mechanism of bfrg gene on Enterococcus faecalis biofilm formation being analyzed. By these experiments, the relationship between bfrg gene expression and Enterococcus faecalis biofilm formation will be confirmed, and the possible molecular mechanism of bfrg gene on biofilm formation will be elucidated. The findings in this research will provide us new targets or methods to develop novel anti-biofilm bactericidal and inhibitory agents.

粪肠球菌的大量增殖并形成生物膜是根尖周病变治疗失败的主要原因。申请者前期研究发现新基因- - 生物膜形成相关基因（bfrg基因）突变的粪肠球菌，其生物膜形成显著降低，提示bfrg基因与细菌生物膜的形成关系密切，但具体机制尚不清楚。本项目采用Realtime PCR和Western blot等方法探明bfrg基因在生物膜形成过程中的表达状态；应用Knock in和Knock out技术上调或下调bfrg的表达，观察其对生物膜形成的影响；进而利用基因表达谱芯片和免疫共沉淀结合质谱分析技术，筛选其调控的下游分子和相互作用分子，探讨bfrg基因影响细菌生物膜形成的分子机制。通过以上研究，明确bfrg基因在粪肠球菌生物膜形成中发挥的具体作用，阐明其调控生物膜形成的分子机制，以此调控通路的相关分子为重要的药物靶点，阻断其对生物膜形成的正调控作用，为研发新型抗细菌生物膜药物和抑制剂提供新思路。

粪肠球菌的大量增殖并形成生物膜是根尖周病变治疗失败的主要原因。申请者前期研究发现新基因- - 生物膜形成相关基因（bfrg基因）突变的粪肠球菌，其生物膜形成显著降低，提示bfrg基因与细菌生物膜的形成关系密切，但具体机制尚不清楚。本项目采用Realtime PCR和Western blot等方法探明bfrg基因在生物膜形成过程中的表达状态；应用Knock in和Knock out技术上调或下调bfrg的表达，观察其对生物膜形成的影响；进而利用基因表达谱测序技术，筛选其调控的下游分子和相互作用分子，探讨bfrg基因影响细菌生物膜形成的分子机制。通过以上研究，明确bfrg基因在粪肠球菌生物膜形成中发挥的具体作用，阐明其调控生物膜形成的分子机制。本课题通过研究发现bfrg 基因在生物膜形成过程中高表达状态；与对照的野生型E. faecalis 菌相比，bfrg 基因突变菌株形成的细菌生物膜无论在总量上还是在其活细胞含量上，都显著降低（超过50%），进一步研究证实bfrg 基因的突变并没有影响细菌的生长繁殖，说明bfrg 基因能够促进粪肠球菌生物膜的形成。采用基因表达谱测序的方法，寻找bfrg 基因的突变后的差异表达基因，共同比较发现有152个基因的表达在4组细菌中都是下调的，有10个基因的表达在这4组中都是上调的。这些表达变化的基因都可能参与了bfrg 基因对粪肠球菌生物膜形成的调控。其中包括氮代谢通路，它可能在bfrg基因调控生物膜中发挥作用，对gltA基因表达量变化与粪肠球菌生物膜形成进行了验证试验，证明氮代谢通路能调控细菌生物膜的形成。说明氮代谢通路可能是bfrg 基因调控粪肠球菌生物膜形成的机制之一，有可能作为新型抗细菌生物膜药物和抑制剂的新的靶点。对于bfrg基因与gltA基因之间的具体关系，它们之间是否有相互作用，是直接的相互作用，还是间接的作用及其可能的分子通路，仍有待于进一步的研究。