EGF和TGF-α参与舌苔形成的信号转导机制研究

舌苔是舌诊辅助疾病诊断的重要内容，舌苔形成与舌背丝状乳头的生理状态密切相关，丝状乳头被覆复层鳞状上皮，细胞角化成熟和凋亡是舌苔形成的细胞生物学基础，但其详细机制尚不清楚。本项目拟利用撤除血清诱导舌鳞癌细胞凋亡，模拟舌苔形成相关细胞凋亡过程，通过RT-PCR获得总RNA的cDNA后，Real-time PCR研究EGFR相关信号通路分子及NF-κB、Bcl-2/Bax、Caspase等凋亡相关分子和角蛋白的mRNA表达水平，Western blot检测蛋白质表达水平，并结合信号转导激酶抑制剂阻断相关信号转导通路，阐明EGF、TGF-α干预舌鳞癌细胞凋亡的信号转导通路的机制，进而揭示舌苔形成相关细胞凋亡的信号转导通路及EGFR相关信号通路调控舌苔形成的分子机制，为深入研究临床舌苔辨证辅助疾病诊断的科学意义提供理论基础。

建立撤血清舌鳞癌细胞模拟舌苔形成相关细胞凋亡，撤除血清24h可以诱导舌鳞癌细胞发生G0/G1期阻滞和凋亡，表现为细胞增殖停滞、线粒体肿胀、细胞空泡化、细胞胀大，蛋白Bcl-2/Bax比值、E-cad、CK14表达下降，提示撤除血清是舌苔形成相关细胞凋亡的始动原因，蛋白NF-κB P50/P65比值下降提示撤除血清诱导舌鳞癌细胞基因表达功能下降，荧光定量PCR芯片结果提示撤血清诱导舌鳞癌细胞周期阻滞与凋亡与MAPK信号通路相关。.利用EGF和TGF-α干预模型，发现1-10 ng/ml EGF和TGF-α可促进撤血清舌鳞癌细胞的增殖活性，而20 ng/ml反而抑制细胞增殖活性，5 ng/ml EGF和TGF-α促增殖活性差异明显。EGF和TGF-α 5 ng/ml可以抵抗撤除血清诱导的G0/G1期阻滞、细胞凋亡，而且与APDC、SB203580、AG490、AG825、LY294002等激酶抑制剂联用能够增强这种抵抗作用，而与PD98059联用则无效，提示EGF和TGF-α抵抗撤除血清诱导的G0/G1期阻滞和细胞凋亡不依赖MAPKK/MEK信号通路。值得注意的是，erbB 2被抑制后舌鳞癌细胞发生明显凋亡，提示撤血清舌鳞癌细胞的周期阻滞和凋亡依赖erbB 2相关信号通路。蛋白组学结果显示，EGF和TGF-α可以促进抗凋亡相关蛋白的表达而抵抗凋亡。.实时荧光定量PCR芯片结果显示，EGF和TGF-α下调EGFR/VEGFR信号通路相关分子mRNA的表达水平，特别是EGF和EGFR mRNA的表达水平。ELISA实验证明EGF和TGF-α能够促进舌鳞癌细胞分泌PGE2，免疫印迹实验发现EGF和TGF-α可上调Cox-2的蛋白表达水平。我们推测舌鳞癌细胞通过自/旁分泌作用产生PGE2和EGF，这两种具有抵抗细胞凋亡和促进细胞增殖作用的分子存在某种平衡机制，EGF和TGF-α在促进PGE2分泌的同时，下调EGF和EGFR mRNA的表达水平，EGF和TGF-α与EGFR信号通路的相互作用可能存在负反馈作用。.本项目初步发现口腔常见理化因素（热冲击、脂多糖（LPS）、缺氧-复氧、氧化应激）及中药复方（周氏克金岩方和千金苇茎汤）有效部位可以通过抑制细胞增殖活性和PGE2分泌而促进舌苔形成相关细胞凋亡，提示舌苔形成相关细胞凋亡还受到口腔常见理化因素的影响，值得深入研究。