白细胞-血管内皮细胞黏附机制在癫痫发生发展中的作用研究

The blood-brain barrier (BBB) leakage has been proven to induce seizures. Our previous studies found that immuno-inflammatory mechanisms play an important role in the process of BBB leakage and epilepsy. The adhesion between the leukocytes and vascular endothelium is an important feature of the inflammatory process; therefore we speculated that the interaction between leukocytes and vascular endothelium may be involved in the development of epilepsy. So in this study, we first of all to generate brain slice model for epilepsy in vitro, then use patch clamp to record the changes of electrical activity; use immunofluorescence and western blot to investigate the expression of adhesion molecules. Secondly, we establish rat epilepsy model, then use fluorescein sodium methods to observe the degree of BBB leakage; use confocal microscopy and western blot to detect the expression changes in adhesion molecule between leukocytes and vascular endothelium. We investigate the alteration of BBB leakage and seizure after application of blocking antibodies combined with siRNA silencing to inhibit the expression of adhesion molecule. Finally, we use the immunohistochemical methods to verify the results of animal experiments in brain specimens from clinical patients with epilepsy, in order to clarify the relationship between adhesion molecule and epilepsy. In this study we intend to explore the mechanism of the role of adhesion function between leukocytes and vascular endothelial in the development of epilepsy, and further to provide a new research direction for the pathogenesis of epilepsy, and a new target for prevention and treatment of epilepsy.

血脑屏障（BBB）渗漏被证实可诱导痫性发作。我们前期研究发现,免疫炎症机制在BBB渗漏和癫痫发病过程中起重要作用。白细胞与血管内皮间的黏附是炎症过程的重要特征，推测白细胞与血管内皮间相互作用可能参与了癫痫发生发展。为此，本研究拟首先体外建立癫痫脑片模型，膜片钳记录脑电变化，免疫荧光、western blot等观察黏附分子的表达；其次建立大鼠癫痫模型，采用荧光素钠等方法观察BBB渗漏程度，共聚焦显微镜、western blot 等观察白细胞-血管内皮间主要黏附分子表达变化，联合应用封闭抗体抑制或siRNA沉默粘附分子表达后,观察BBB及癫痫活动的变化；随后采用免疫组化等方法在临床癫痫脑标本上验证动物实验结果，阐明白细胞-血管内皮间黏附分子与癫痫发生发展的关系。探讨白细胞与血管内皮间粘附机制在癫痫发生发展中的作用机制，为癫痫发病机制提供新的研究方向，为癫痫防治提供新的作用靶点。

项目背景：血脑屏障（BBB）渗漏被证实可诱导痫性发作。我们前期研究发现,免疫炎症机制在BBB渗漏和癫痫发病过程中起重要作用。白细胞与血管内皮间的黏附是炎症过程的重要特征，推测白细胞与血管内皮间相互作用可能参与了癫痫发生发展。.项目主要研究内容：为探讨白细胞与血管内皮间粘附机制在癫痫发生发展中的作用机制，分别首建立体外癫痫脑片模型、大鼠癫痫模型，并采集癫痫患者术后海马病理，利用膜片钳记录脑电变化，利用共聚焦显微镜、免疫荧光、western blot等技术观察黏附分子的表达，观察BBB及癫痫活动的变化，阐明白细胞-血管内皮间黏附分子与癫痫发生发展的关系。.项目重要结果：.1.在患者海马术后病理标本中，免疫组化、TUNEL、FJC染色等方法表明血脑屏障明显受损，角质细胞激活，粘附分子沿受损血管屏障表达增加，白蛋白外渗增多，组织中存在大量凋亡神经元细胞及激活的Caspase-3信号。.2.白细胞浸润能够诱发颞叶癫痫大鼠癫痫复发：动物研究表明，静脉注入激活白细胞能够诱发癫痫复发并缩短癫痫发作潜伏期，利用Western blood技术、免疫荧光技术、免疫组化l检测到激活白细胞后脑实质内浸润白细胞明显增多、粘附分子表达明显增多、血脑屏障破坏加重、神经元损伤加重。.3.神经元摄取白蛋白加重癫痫大鼠神经元损伤：大鼠癫痫发作后，EB染色提示血脑屏障明显受损，大部分外渗的血浆白蛋白被神经元摄取，摄取白蛋白的神经元损伤明显，大部分死亡后被吸收。.4. PDTC抑制癫痫持续状态大鼠海马MCP-1过度表达及胶质细胞过度激活: 在匹罗卡品大鼠癫痫模型中，胶质细胞及神经损伤明显，而免疫组化、FJC、NEUN染色技术检测到PDTC能够明显抑制胶质细胞激活，并减少MCP-1的过表达，并抑制神经元变性。..科学意义：以上结果表明血脑屏障破坏在癫痫发生发展过程中起重要作用，白细胞-血脑屏障相互作用能够诱发癫痫复发并加重神经元死亡、血脑屏障破坏等病理改变，血脑屏障受损后白蛋白外渗也能够加重神经元破坏死亡。保护血脑屏障是癫痫治疗过程中的重要靶点。