CRISPR/Cas9基因编辑与iPSCs定向分化CAR-T淋巴细胞及其可视化与生物学表征

CAR-T cell immunological therapy is an emerging technology that uses CAR-T lymphocytes to attack and destroy malignant tumors, and is promising to conquer cancer in the future. However, there is still a lack of effective prediction, real-time monitoring and limited ability of CAR-T amplification in vitro. In this project, a novel technology to obtain safe and accessible CAR-T cells will be established firstly. T lymphocytes will be extracted from healthy person or patients, then induced to pluripotent stem cells. After that, the gene of CAR and NIS will be knocked in induced-pluripotent stem cells (iPSCs) using CRISPR/Cas9 gene editing technology to prepare CAR-T cells. Secondly, nuclear medicine molecular imaging will be used to monitor the treatment of CAR-T lymphocytes in real-time, including the antitumor activity of CAR-T lymphocytes in vitro and in vivo, the dynamic biodistribution in main tissues and organs in vivo, the dynamic retention & survival time, the property of targeting, the side-effects and so on. Based on the results of monitoring, CAR-T lymphocytes will be reconstructed. Through the research of CAR-T cells prepared by the NIS-CAR-iPS and the monitoring by nuclear medicine imaging technology, the clinical transformation of CAR-T cell therapy will be promoted greatly.

CAR-T治疗是将抗体对抗原的高特异性和T细胞对肿瘤的细胞毒性相结合的方法，已成为癌症综合治疗的前沿研究之一。为了改进CAR-T仍存在脱靶效应、细胞因子风暴、T细胞来源有限及改造风险、对实体瘤疗效不佳等问题。本项目拟利用前期工作获得的重编程多能干细胞（iPSC），采用CRISPR/Cas9系统对iPSC进行基因修饰，在AVVS1安全港位点敲入CAR及NIS基因，再将改造后的iPSC诱导分化为有肿瘤靶向杀伤功能的NIS-CAR-iPS-T细胞，在规避生物安全风险的同时使其具备摄碘功能，以实现核医学显像实时体外监控。通过对NIS-CAR-iPS-T细胞的制备、生物学特性表征、体内外示踪监控及对其再改造等研究，掌握CAR-T细胞在患者体内真实“存在-工作”状态和规律，建立一套CAR-T治疗的监测方案和评价体系，以满足临床治疗安全有效及经济适用等要求，进一步推进CAR-T治疗的理论研究和临床转化。

CAR-T治疗是利用细胞工程技术在T细胞上表达特异性识别肿瘤细胞标志物的分子，并启动T细胞对肿瘤的细胞毒性达到清除肿瘤的目的，是最有前景的癌症免疫治疗方法之一。但是目前仍存在脱靶效应、细胞因子风暴、T细胞来源有限及改造风险、对实体瘤疗效不佳等问题。本课题的研究目标是：采用CRISPR/Cas9系统对人诱导多能干细胞（hiPSC）进行基因修饰，在AAVS1位点敲入NIS基因，再将改造后的hiPSC诱导分化为有肿瘤靶向杀伤能力的NIS-CAR-hiPS-T细胞，使其获得摄碘能力，以实现核医学显像实时在体监测CAR-T治疗的脱靶效应、细胞因子风暴、肿瘤疗效，同时利用hiPSC具有无限传代特性诱导分化为T细胞解决T细胞来源问题以提高大量制备CAR-T细胞的工作效率。具体内容如下：（1）选用碘的类似物四氟硼酸（Tetrafluoroborate，TFB）建立NIS- [18F]TFB-PET显像系统。（2）设计sgRNA序列，构建特异靶向AAVS1位点的CRISPR/Cas9质粒及NIS基因的同源臂质粒，获得NIS-hiPSC定向分化为NIS-hiPS-T细胞。（3）构建靶向CD19的CAR质粒，包装为慢病毒感染NIS-hiPS-T细胞获得NIS-CAR-hiPS-T细胞。（4）体内外评价NIS-CAR-hiPS-T细胞对肿瘤CD19+细胞的特异性靶向能力、免疫杀伤效应，建立一套CAR-T细胞治疗的核医学分子影像学监测平台，为提供影像学支持。本项目已建立了一套CAR-T治疗的监测方案和评价体系，初步探讨了CAR-T细胞在荷瘤裸鼠体内分布和影像学特征与脱靶效应、细胞因子风暴、实体肿瘤疗效之间的关系。相关工作项目已完成四篇SCI论文的投稿，在国内学术会议上投稿交流四篇。基本保质保量完成了课题研究计划内容。受新冠病毒肺炎疫情影响，部分研究工作正在进行中，预计还有四篇SCI论文待撰写发表。