基于CRISPR/Cas9的家蚕丝蛋白基因全位点饱和编辑与丝纤维遗传改良研究

Sericulture is the great invention of Chinese people and become an important cultural feature of Chinese nation. However, sericulture in China meets huge challenge in the new century. Focusing on the performance of Bombyx silk, which is the major couse of the current situation, we propose two major scientific questions to reveal the molecular mechanism of silk performance determination, and to genetically engineer the silk fiber. What is the correlation between protein structures and silk performance? How to generate new silk fiber with advanced performance? These two questions are extremely important, but largely unknown to date. Based on the silk protein gene knock-out lines and Cas9 silkworm genome editing platform, this study will systematically identify silk protein components, saturation edit of major silk protein genes, uncover the critical animo acid involved in performance determination. Through these studies, we will reveal the molecular mechanism of silk performance determination, establish the molecular tools to engineer the silk fiber, and finally generate new fibers with advanced performance.

蚕桑丝绸是中华民族的伟大发明和重要文化标识。进入新世纪以来，我国蚕桑丝绸产业面临着前所未有的巨大挑战。本项目针对造成产业发展困境的关键成因（蚕丝的固有缺陷导致生产和加工效率低，应用领用狭窄），围绕蚕丝纤维性能的决定机制和遗传改良提出两个关键科学问题：（1）蛋白质结构与蚕丝纤维性能的关系模型；（2）新型蚕丝创制的理论和技术基础。拟以已经获得的丝蛋白基因敲除品系和Cas9家蚕基因组编辑技术体系为基础，对蚕丝蛋白组分进行系统的鉴定，针对主要的丝蛋白编码基因开展全位点饱和基因组编辑，鉴定与蚕丝纤维性能密切相关的关键位点，在此基础上实现丝素蛋白的性能优化，最终阐释蚕丝纤维性能决定的分子机制，开发改性蚕丝纤维的分子工具，并创制具有特定性能的新型蚕丝纤维。本项目聚焦蚕丝这一关键科学问题，有效利用前沿技术，巧妙整合理论创新与应用，可能为改善蚕丝纤维性能、促进蚕桑丝绸产业转型升级提供参考和奠定基础。

自嫘祖始蚕开始，蚕桑丝绸已经历5000多年的积累和发展。然而随着新世纪工业化进程的飞速发展，传统的蚕桑丝绸产业面临转型升级的巨大压力，亟待打破瓶颈。本项目针对蚕丝纤维性能的决定机制和遗传改良这一关键科学问题，在前期建立基因组编辑技术的基础上，通过对丝蛋白基因进行系统克隆鉴定和饱和编辑，探索了蚕丝纤维性能的决定机制，并在此基础上采用多种方式对蚕丝纤维进行了遗传改良。获得的主要研究结果如下：（1）建立了基于Cas9切割和SMRT单分子测序的丝蛋白全长克隆技术，解决了困扰业界20余年的丝蛋白研究难题，首次获得了7种野桑蚕和17种家蚕Fib-H基因的序列鉴定，发现Fib-H基因的NTD和CTD氨基酸序列完全一致，而重复结构域具有较强的可变性；通过高分辨进行分段蛋白质组学，首次发现了家蚕和野蚕茧层中新的功能性丝蛋白组分和新的结构性丝蛋白基因。（2）在已经建立的家蚕基因组编辑技术上，整合效率提升、位点扩展、单碱基编辑、多位点编辑等新技术，构建了针对丝蛋白的饱和编辑技术体系，在此基础上制备了BmFib-H、BmFib-L和BmP25基因饱和编辑的gRNA个体文库，发现了BmFib-H第50、71、73位氨基酸为丝蛋白的关键位点。（3）对获得的代表性丝蛋白基因突变体进行了系统的分子机制解析，发现BmFib-L敲除不影响丝蛋白分泌，但是影响成丝；Fib-H的C末端缺失导致Fib-H不能分泌，丝腺细胞萎缩；（4）在丝蛋白系统解析和编辑突变体筛选的基础上，采用多种途径对蚕丝蛋白进行了遗传改造，设计人工组装重复单元加倍策略，完成不同倍数的Fib-H基因重复单元构建，证明重复单元的数量与丝纤维性能密切相关，发现四龄末丝的力学性能最强。本项目为前沿生物技术和蚕桑产业的需求搭建转化桥梁，为蚕丝纤维的遗传改良和应用拓展奠定了坚实的基础。